無塵食品車間裝修:中國藥品檢驗標準操作規程2010版-微生物限度檢查法全文

 xinwen   2020-03-14 11:43   263 人閱讀  0 條評論

關于無塵食品車間裝修內容如下:

一、細菌、霉菌和酵母菌計數

1 簡述

細菌、霉菌和酵母菌計數是檢測非規定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是用于評價生產企業的藥用原料、輔料、設備、器具、工藝流程、環境和操作者的衛生狀況的重要手段和依據。

細菌、霉菌和酵母菌計數均采用平板菌落計數法,這是活菌計數的方法之一,也是目前國際上許多國家常用的一種方法。以在瓊脂平板上的細菌、霉菌和酵母菌形成一個獨立可見的菌落為計數依據。該法測定結果只反映在該規定條件下所生長的細菌(為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數。不包括對營養、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。

一個細菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一個或多個菌細胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數,實際為菌落形成單位數(colony forming unity,cfu),不應理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數。

2 設備、儀器

2.1 設備

2.1.1 潔凈實驗室

微生物限度檢查應有單獨的潔凈實驗室,每個潔凈實驗室應有獨立的凈化空氣系統。

2.1.1.1 結構和要求 潔凈實驗室應采光良好、避免潮濕、遠離廁所及污染區。操作間與緩沖間之間應有樣品傳遞艙,出入操作間和緩沖間的門不應直對。潔凈實驗室內應六面光滑平整,能耐受清洗消毒。墻壁與地面、天花板連接處應呈凹弧形,無縫隙,不留死角。操作間內不應安裝下水道。

潔凈實驗室內的照明燈應嵌裝在天花板內,室內光照應分布均勻,光照度不低于300LX。

2.1.1.2 溫度、濕度 潔凈實驗室內的溫度應控制在18~26℃,相對濕度最好在40%~60%。

2.1.1.3 操作間 操作間應安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應低于10000級,局部潔凈度為100級(或放置同等級凈化工作臺)。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應保持對環境形成正壓,不低于10Pa,操作間與緩沖間也應保持相對正壓,不低于5Pa。操作臺上備有藥物天平,乙醇燈,火柴,乙醇棉球,大、小橡皮乳頭等。

2.1.1.4 緩沖間 緩沖間內應有洗手盆和無菌衣、帽、口罩、鞋套等。

2.1.1.5 潔凈級別及檢查方法 通常采用塵粒數及浮游菌數或沉降菌數測定法(參照《醫藥工業潔凈室》(區)懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法》的現行國家標準)進行潔凈度驗證。

不同潔凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準見下表1。

表l 不同潔凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準

潔凈級別

塵埃數ㄍm3

浮游菌(個)ㄍm3

沉降菌(個)ㄍ

(φ90mm?0.5h)

微粒直徑≥0.5μm

微粒直徑≥5μm

100級

≤3,500

≤0

≤5

≤1

10000級

≤350,000

≤2000

≤100

≤3

100000級

≤3,500,000

≤20,000

≤500

≤10

沉降菌數測定(Ⅱ法)

潔凈實驗室操作臺消毒擦拭處理后,先啟動層流凈化裝置30min,將備妥的營養瓊脂平板3個(經30~35℃預培養48h,證明無菌落生長)。以無菌方式(或經傳遞箱)移人操作間,置凈化臺左、中、右各1個,開蓋,暴露30min后將蓋蓋上。在30~35℃培養箱內倒置培養48h,取出檢查。3個平板生長的平均菌落數不超過1個。

有條件的單位,同時應檢查潔凈操作間和凈化工作臺上的浮游菌和微粒數。

操作問和凈化工作臺要定期檢測其潔凈度,分別應達到10000級和100級。如菌落數或微粒數超標,應清洗過濾系統中的過濾設施,必要時予以更換。

2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1%苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角,然后啟動層流凈化裝置。

2.1.2 陽性菌實驗室

涉及實驗室監控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、方法驗證試驗中的陽性菌操作等實驗活動,應在專門的陽性菌實驗室進行。除另有規定外,陽性菌實驗室應符合國家Ⅱ級生物安全標準,陽性菌實驗室應配備生物安全柜。陽性菌操作不得在供試品檢驗用潔凈實驗室內進行。

2.1.3 潔凈實驗室、陽性菌實驗室與洗刷、滅菌、消毒、培養及結果觀察的工作間等設施應相對集中,布局合理,避免污染,便于管理。

2.2 儀器

2.2.1 恒溫培養箱(30~35℃)、生化培養箱(23~28℃)、微波爐、勻漿儀(3000~8000 r/min)或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱(100~300℃)、電冰箱、離心機、離心管、微孔濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器(使用時要進行滅菌效果檢查并應定期請有關部門檢定)。

菌落計數器、顯微鏡(40×~1500×)、電子天平或藥物天平(感量0.1g),pH計。

2.2.2 玻璃器皿 錐形瓶(250~300ml、500ml內裝玻璃珠若干)、培養皿(9cm)、量筒(100ml,500m1)、試管(18mm×180mm)及塞、吸管(1m1分度0.0l,10m1分度0.1)、注射器(20ml或30m1)、涂布棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸(帶蓋)、不銹鋼桶(帶蓋)。玻璃器皿用前應洗滌干凈,吸管、量筒不掛水滴,無殘留抗菌物質。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花,置吸管筒內或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應加棉塞或硅膠塞,若用振蕩器制備混懸液時,尚需用玻璃紙包裹瓶塞,以免振蕩時供試液污染瓶塞,再用牛皮紙包扎。玻璃器皿,均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min,烘干備用。

2.2.3 用具 大、小橡皮乳頭(放于干凈帶蓋的容器中,并應定期用70%~75%乙醇溶液浸泡)。無菌衣、帽、口罩、手套(洗凈后配套,用牛皮紙包嚴)滅菌,備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。

接種環(白銥金或鎳鉻合金,環徑4~5mm、長度6~10cm)、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋(12cm)、實驗記錄紙等。

3 試液、稀釋劑和試劑

3.1試液

3.1.1 0.1%苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液(供洗手、擦拭操作臺面用)。

3.1.2 5%石碳酸溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內,供消毒帶菌吸管用)亦可選用其他適宜消毒液。

3.1.3 75%乙醇溶液。

3.1.4 碘酊或碘伏溶液。

3.2 稀釋劑和試劑

稀釋劑配制后,采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。

3.2.1 0.9%無菌氯化鈉溶液(附件二3.1)。

3.2.2 pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液(附件二3.5)。

3.2.3 無菌聚山梨酯80氯化鈉?蛋白胨緩沖液(附件二3.4)。

3.2.4 pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(附件二3.3)。

3.2.5 無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液(附件二3.2)。

3.2.6 無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液(TTC)(附件二2.15)。

3.2.7 pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液(附件二3.3)。

4 培養基

4.1 營養瓊脂培養基(附件二5.2)。

4.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養基(附件二5.4)。

4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養基(附件二5.5)。

培養基制備注意事項:

4.3.1 采用干燥培養基,按說明配制,應對滅菌后的培養基pH進行校驗。若為自配培養基,原料應挑選,瓊脂凝固力應測定,以確定配制時瓊脂用量。試劑規格應為化學純以上。

4.3.2 配制的培養基不應有沉淀。如有沉淀,應于溶化后趁熱過濾,滅菌后使用。

4.3.3 培養基的分裝量不得超過容器的2/3,以免滅菌時溢出。包裝時,塞子必須塞緊,以免松動或脫落造成染菌。

4.3.4 培養基配制后應在2h內滅菌,避免細菌繁殖。

4.3.5 滅菌后的培養基應保存在2~25℃,防止被污染,可在3周內用畢;保存于密閉容器中,可在1年內使用。制備好的培養基放置時間不宜過長,以免水分散失及染菌。

4.3.6 宜采用用水浴或微波爐加熱熔化瓊脂培養基,勿用電爐直接熔化瓊脂培養基,以免營養成份過度受熱而破壞。已熔化的培養基應8h內一次用完,剩余培養基不宜再用。

4.4 培養基適用性實驗的要求及操作見本操作規程第三部分。

5 供試品抽樣、保存及檢驗量

5.1 抽樣

5.1.1 一般采用隨機抽樣方法,其抽樣量應為檢驗用量(2個以上最小包裝單位)的3~5倍量(以備復試或留樣觀察)。

5.1.2 抽樣時,凡發現有異?;蚩梢傻臉悠?,應選取有疑問的樣品。機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。

5.1.3 凡能從藥品、瓶口(外蓋內側及瓶口周圍)外觀看出長螨、發霉、蟲蛀及變質的藥品,可直接判為不合格品,無需再抽樣檢驗。

5.2 保存

5.2.1 供試品在檢驗之前,應保存在陰涼干燥處,勿冷藏或冷凍,以防供試品內污染菌因保存條件不妥致死,損傷或繁殖。

5.2.2 供試品在檢驗之前,應保持原包裝狀態,嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品進行檢查。

5.3 檢驗量

5.3.1 所有劑型的檢驗量均需取自2個以上包裝單位(中藥蜜丸需取自4丸、膜劑取4片以上)。

5.3.2 固體及半固體(黏稠性供試品)制劑檢驗量為10g。

5.3.3 液體制劑檢驗量為10ml。

5.3.4 膜劑除另有規定外,檢驗量為100cm2。

5.3.5 特殊貴重或微量包裝的藥品,檢驗量可酌減。除另有規定外,口服固體制劑不低于3g,液體制劑采用原液者不得少于6ml,采用供試液者不得少于3ml,外用藥品不得少于5g。

要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g或20ml(其中10g或10ml用于陽性對照試驗)。

6 試驗準備

6.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管(1ml、10m1)、量筒、稀釋劑等移至潔凈實驗室內。每次試驗所用物品必須事先做好計劃,準備足夠用量,避免操作中出入潔凈實驗室。編號后將全部外包裝(牛皮紙)去掉。

6.2 開啟潔凈實驗室空氣過濾裝置,并使其工作不低于30min。

6.3 操作人員用肥皂或適宜消毒液洗手,進入緩沖間,換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。

6.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍,待干后用滅菌的手術鑷或剪將供試品啟封。

7 供試液的制備

根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。所用乳化劑,分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應證明是有效的,并對微生物無毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時,溫度不應超過45℃,時間不得超過30min。除另有規定外,常用的供試品制備方法如下:

7.1 液體供試品 取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,作為供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。

7.2 固體、半固體或黏稠液供試品 取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

7.3 非水溶性供試品

7.3.1 軟膏、乳膏劑 取供試品5g(或5m1),加至含溶化的(溫度不超過45℃)司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無菌混合物(溶化,溫度不超過45℃)的燒杯中,即先將燒杯中無菌助溶劑混合物溶化,待溫度不超過45℃時,加入供試品,用無菌玻棒攪拌成團后,分次慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1:20供試液。

7.3.2 油劑 取供試品10ml,加入無菌聚山梨酯80 5~8ml,搖勻,再加入稀釋劑至100ml,作為1:10供試液。

7.3.3 栓劑 稱取供試品10g,置滅菌錐形瓶中,加適量稀釋劑,置45℃水浴保溫10min,使溶,加入無菌聚山梨酯80 5~8ml,振搖使之乳化,再加稀釋劑(稀釋劑和聚山梨酯80總量為100m1),搖勻,作為1:10供試液。

7.3.4 膏劑 取供試品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯(制法見附錄ⅪH“無菌檢查法”)和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液100m1,振搖5~10min,萃取,待油水明顯分層,取其水層作為1:10供試液。

7.4 非水溶性膜劑供試品 一般取樣為100cm2,置滅菌錐形瓶中,加入適量的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液,于45℃±1℃水浴中保溫,浸泡,振搖,以供試品浸液作為l:10供試液。中藥膜劑取100cm2,剪碎,加適量的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液(通常1 cm2加1ml或2m1),浸泡,振搖,以供試品浸液作為1:10供試液。

7.5 腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品10g,腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml,結腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml,均置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1:10供試液。

7.6 氣霧劑、噴霧劑供試品 取規定量供試品,置冰箱冰凍室(-20℃以下)內約1h。取出,迅速消毒供試品容器的開啟部位周圍,用無菌鋼錐在容器上鉆一小孔,在室溫輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的稀釋劑(若含非水溶性成份,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當于10g或10ml的供試品,再稀釋成1:10的供試液。

7.7 茶劑供試品 取供試品10g,置滅菌錐形瓶中,加入稀釋劑100ml,振搖2~3min,以滅菌紗布過濾(如為袋泡茶,可直接取2袋,以稱樣結果按1:10加稀釋劑,浸泡30min)。

以上供試品如吸水膨脹,或黏度過高,可增加稀釋劑的量,制成1:20~1:100供試液。

7.8 貼膏劑供試品 取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30min,或放置于均質儀均質l0min,或以其他方法制備成供試液。

7.9 具抑菌活性的供試品

當供試品具有抑菌活性時,應消除供試液的抑菌活性后,再依法檢查。常用的方法如下:

7.9.1 稀釋法 取規定量的供試液,加至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測定菌數時,1ml供試液可等量分注多個平皿;控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量。培養基稀釋法適用于抑菌作用不強的制劑。

7.9.2 離心沉淀法 此方法用于去除供試液中的沉淀物,對于抑菌活性較強的供試品,如供試液中有不溶顆粒、沉淀,取供試液,先以500 r/min,離心3min,取上清液進行試驗,此方法用于細菌計數和控制菌(細菌)檢查。

7.9.3 薄膜過濾法 見細菌、霉菌和酵母菌計數。

7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐劑的供試品,可用相應的試劑鈍化、中和其抑菌活性,制成供試液。

8 供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法)

8.1 取2~3支滅菌試管,分別加入9ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑(此時操作一般為:左手執試管并將塞打開,傾斜,右手執10ml吸管吸量。切勿在酒精燈火焰的正上方操作,以免火焰將供試液中的菌細胞殺滅)。加稀釋劑后,試管塞應立即塞上。

8.2 另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml,加入裝有9ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中,混勻,即得1:100供試液。以此類推,根據供試品污染程度,可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級。每遞增l稀釋級,必須另換一支吸管。

稀釋時,吸管插入第1級稀釋液內不低于液面2.5cm,反復吸吹約10次。吸液時,應先吸至高于吸管上部刻度少許,然后提起吸管,貼于試管內壁調整液量至刻度,吸管移至第2級稀釋管的內壁近液面處(勿接觸液面)緩慢地放出全部供試液(吸管內應無黏附或殘留液體),然后將吸管放入消毒液缸內。

9 計數方法驗證

由于某些供試品具有抗菌活性,在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發生改變時,可能影響檢驗結果的準確性,必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗證。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。

9.1 驗證用菌株大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102],金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003],枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501],白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001],黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。

菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上,培養18~24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上,培養24~48h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50~100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,培養5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50~l00cfu的孢子懸液。

菌懸液制備后,若在室溫下放置應在2h內使用,若保存在2~8℃的菌懸液可以在24小時內使用。黑曲霉菌的孢子懸液保存在2~8℃,可在驗證過的貯存期內替代對應量的新鮮孢子懸液使用。

9.2 驗證方法 驗證試驗分4組,至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算供試品組和對照組試驗的菌回收率。

9.2.1 供試品組 取最低稀釋級的供試液,按每1ml供試液加入50~l00cfu試驗菌,按菌落計數方法測定其菌數。平皿法計數時,取試驗菌液、供試液各1ml分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基;薄膜過濾法計數時,取供試液2ml過濾,沖洗液沖洗,并在最后一次的沖洗液中加入試驗菌。

9.2.2 活菌組 取上述試驗菌液,測定其加入的試驗菌菌數。

9.2.3 供試品對照組 取最低稀釋級的供試液1ml,按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

9.2.4 稀釋劑對照組 為考察供試液制備過程中對微生物影響的程度,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml含50~l00cfu,按供試品組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

9.3 結果判定對照組的菌回收率均應不低于70%。若供試品組的菌回收率均不低于70%,則可按該供試液制備方法和菌落計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數;若任一次試驗中供試品組的菌回收率低于70%,應建立新的方法,消除供試品的抑菌活性,并重新驗證。

9.4 驗證試驗可與供試品的細菌,霉菌及酵母菌計數同時進行。

9.5 注意事項

9.5.1 所用標準菌種的傳代次數不得超過5代。以冷凍干燥的原始菌種開啟后轉種培養,其培養物為第一代。

9.5.2 黑曲霉菌的菌液制備 將黑曲霉菌接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,于20~25℃培養5~7天,使大量的孢子產生。加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,用無菌玻棒或接種環輕輕將孢子洗脫。然后可用一支l0ml無菌球形毛細吸管,其管口用無菌棉花或紗布包扎且能過濾菌絲的裝置,吸出孢子懸液至無菌試管內,將孢子懸液稀釋至每毫升含50~l00cfu。

9.5.3 做試驗菌的回收率試驗時,加入菌量50~l00cfu為宜。加菌量過多,如薄膜法,菌落擁擠,則不好計數;加菌量過少,則誤差較大。

9.5.4 進行驗證試驗時,若因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗,應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗。此時更高稀釋級供試液的確認要從低往高的稀釋級進行,但最高稀釋級供試液選擇應根據供試品應符合的微生物限度標準和菌數報告規則,如供試品應符合的微生物限度標準是1克細菌數不得過1000cfu,那么最高稀釋級是1:10?3。

若采用允許的最高稀釋級供試液進行驗證試驗還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那么應選擇回收情況最接近要求的方法進行供試品的檢測。如某種產品對某試驗菌有較強的抑菌性能,采用薄膜過濾法的回收率為40%,而采用培養基稀釋法的回收率為30%,那么應選擇薄膜過濾法進行該供試品的檢測。在此情況下,生產單位或研制單位應根據原輔料的微生物質量、生產工藝及產品特性進行產品的風險評估,以保證檢驗方法的可靠性,從而保證產品質量。

10 檢查法

10.1 平皿法

10.1.1 在上述進行10倍遞增稀釋的同時,以該稀釋級吸管,吸取該稀釋級供試液各1ml至每個直徑90mm的滅菌平皿中,或從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸管吸供試液各1ml至每個滅菌平皿中。每一稀釋級每種培養基至少注2~3個平皿(一般為左手執平皿,將蓋半開,右手執吸管),注皿時,將1ml供試液慢慢全部注入平皿中,管內無殘留液體,防止反流到吸管尖端部。

10.1.2 陰性對照 待各級稀釋液注皿完畢后,用1支1ml吸管吸取試驗用稀釋劑(pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)各1ml,分別注入4個平皿中。其中2個作細菌數陰性對照;另2個作霉菌、酵母菌數陰性對照,如另用YPD瓊脂測定酵母菌數時,則再增加2個平皿作酵母菌數陰性對照。

10.1.3 傾注培養基

將預先配制好的細菌計數用的營養瓊脂培養基;霉菌、酵母菌計數用的玫瑰紅鈉瓊脂培養基;含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基(霉菌)和YPD瓊脂培養基(酵母菌)熔化,冷至約45℃時,傾注上述各個平皿約15ml,以順時針或反時針方向快速旋轉平皿,使供試液或稀釋液與培養基混勻,蓋上陶瓦蓋,或半蓋蓋,除去冷凝水后,再移去陶瓦蓋后,蓋上平皿蓋置操作平臺上待凝。在旋轉平皿時切勿將培養基濺到皿邊及皿蓋上。

10.1.4 培養

細菌計數平板倒置于30~35℃培養箱中培養3天。霉菌、酵母菌計數平板倒置于23~28℃培養箱中培養5天,必要時延長至7天。逐日觀察菌落生長情況,點計菌落數。

10.1.5 菌落計數

10.1.5.1 一般將平板置菌落計數器上或從平板的背面直接以肉眼點計,以透射光襯以暗色背景,仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間,以及菌落與供試品顆粒、培養基沉淀物、氣泡、油滴等的區別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察,或挑取可疑物涂片鏡檢。

10.1.5.2 供試品如為微生物制劑,應將有效微生物菌落排除,不可點計在細菌、霉菌和酵母菌數內。排除的方法需按該制劑微生物品種而定,并須觀察菌落特征及染色形態。

10.1.5.3 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料,培養基注皿后亦可能產生沉淀物,經過培養后有時形成數量很多的有形物,且難與菌落相區別。為了有利于菌落計數,可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿(1~2個平皿)。注皿后不經培養而放置于冰箱(勿結凍)中。在計數菌落時作為對照?;蛴煤琓TC營養瓊脂注皿,經培養后該培養基生長的菌落為紅色,襯于白色背景上易于點計細菌菌落和區分其他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品,經營養瓊脂注皿后呈乳白色,培養后生長的菌落不易辨認和點計,為防止這種情況,也可用含TTC營養瓊脂注皿。TTC的用量應以不抑制微生物生長為宜,通常使用的濃度為0.001%。

10.1.5.4 若平板上有2個或2個以上菌落重疊,肉眼可辨別時仍以2個或2個以上菌落計數;若平板生長有鏈狀或片狀、云霧狀菌落,菌落間無明顯界線,一條鏈、片作為一個菌落計,但若鏈、片上出現性狀與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時,仍應分別計數,若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落,其外緣有若干性狀相似的單個菌落,一般不宜作為計數用。

10.1.5.5 菌落生長呈蔓延趨勢者,細菌需在24h,霉菌需在48h做初步點計(點計霉菌菌落時,輕輕翻轉平板,勿反復翻轉,否則使早期形成的孢子散落在平板的其他部位,又萌生新的霉菌菌落,導致計數誤差)。

10.1.5.6 在培養3天點計細菌,培養5天點計霉菌時,如菌落極小,不易辨認,細菌計數可延長培養時間至5天;霉菌及酵母菌計數可延長培養時間至7天,再點計菌落數。

10.1.5.7 對有異議的供試品以YPD培養基作酵母菌計數時,可培養至1周再點計菌落數。

10.1.5.8 含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基點計霉菌數,YPD瓊脂培養基點計酵母菌數。兩者合并計數。

10.1.5.9 在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數。然后將營養瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數多的培養基中的菌數為計數結果。

10.1.6 菌數報告規則

10.1.6.1 宜選取細菌、酵母菌平均菌落數小于300cfu、霉菌菌落數平均數小于100cfu的平板計數作為菌數報告(取兩位有效數字)的依據。

10.1.6.2 當僅有1個稀釋級的菌落數符合上述規定,以該級的平均菌落數乘以稀釋倍數報告菌數;當有2個或2個以上稀釋劑的菌落數符合上述規定,以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數值的值報告。

10.1.6.3 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均茵落數小于1時,以小于1乘以最低稀釋倍數報告菌數。

菌數報告規則示例見下表2。

表2 菌數報告規則示例

菌數報告

規則示例

各稀釋級(供試液1mlㄍ皿)平均菌落計數(cfu)

菌數報告數

(cfuㄍg,ml,10cm2)

原液

1:10(-1)

1:102(-2)

1:103(-3)

1

——

64

8

2

640

2

——

420

64

8

6400

3

——

不可計

420

64

64000

4

——

0

0.5

0

<100

5

——

——

0

0

<100

6

——

0

0

0

<10

7

0

0

0

——

<1

10.2 薄膜過濾法

10.2.1 薄膜過濾法主要起到富集微生物、分離去除樣品中對微生物生長產生干擾的因素的作用,可以有效提高檢查結果的靈敏度和可靠性,是近年來微生物檢查領域中日益廣泛應用的一種技術手段。

10.2.2 薄膜過濾法采用的濾膜孔徑應不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm,為便于計數,以及減輕供試液堵塞濾膜的情況,在便于操作的前提下,可以選用直徑更大的濾膜或薄膜過濾器。采用不同直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。

10.2.3 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,以濾膜直徑為50mm的濾膜計,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml;其他直徑的濾膜及薄膜過濾器可按膜面積比例調整,總的原則是避免大體積、過高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷。

10.2.4 由于供試液中一些不能通過濾膜的顆粒存在,常常造成濾膜堵塞、壓力升高,嚴重情況時可能發生過濾裝置炸裂造成安全事故或實驗室污染;也可能發生由于壓力過大濾膜開裂或濾膜孔徑變大,造成濾膜對微生物的過濾截留失敗。所以,實際操作中應考慮對薄膜過濾中的壓力控制和設備的安全性,設置一定的安全壓力限度,例如濾膜兩側壓差不得過50psi。具體壓力限度應根據具體薄膜過濾裝置及濾膜確定。

10.2.5 采用適當方法去除供試液中的顆粒(前提是不能影響微生物的回收率)、適當增加薄膜面積或降低過濾液體流速可以有效降低濾膜兩側的壓力差。

10.2.6 取相當于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量見10.2.3及10.2.4。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時不得有空隙或氣泡,否則影響微生物生長。

10.2.7 貼膏劑宜采用薄膜過濾法進行細菌、霉菌及酵母菌計數。

10.2.8 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

10.2.9 培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100cfu。

10.2.10 菌數報告規則 以相當于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌落生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品),或<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

10.3 培養基稀釋法

取低稀釋級供試液(原液或1:10供試液或其他供試液)2份,每份各1ml,分別注入平皿中(每皿0.5ml、0.2ml或<0.2m1),每1個平皿傾注營養瓊脂培養基約15ml,混勻,凝固后,倒置培養,計數。

每份供試液所加注平板點計的菌落之和,即為每lml菌落數,共得2組數據。以2份低稀釋級供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。

10.4 結果報告

10.4.1 菌落數在100以內時,按實有數據報告。

10.4.2 菌落數大于100時,取兩位有效數字報告,第三位按數字修約規則處理。

10.5 復試

供試品細菌數、霉菌及酵母菌數其中任一項一次檢驗不合格,應從同一批樣品中隨機重新取2倍包裝量的供試品,依法作單項復試兩次,以三次檢驗結果的均值報告。若3次結果的平均值超過該品種項下的規定,判供試品不符合規定;否則,判供試品符合規定。

10.6 注意事項

10.6.1 菌落計數測定每計數單位(每皿或每膜)的最適計數范圍不宜過低,通常每計數單位不應少于25cfu,低于這一限度越多誤差越大,故應根據實際微生物限度標準和污染程度確定適宜的供試液稀釋級數和計數測定方法。當標準限度過低或因為操作需要供試品稀釋程度過高,可以取較大體積供試液通過薄膜過濾法富集計數測定。不同限度標準宜采用的供試液稀釋級及對應宜采用的計數測定方法見下表3。

表3 不同限度標準宜采用的供試液稀釋級及對應宜采用的計數測定方法

限度標準

cfuㄍg,ml,10cm2

一般2~3個供試液稀釋級對應宜選用的計數測定方法

原液

1:10(-1)

1:102(-2)

1:103(-3)

1:104(-4)

<10

10

●■

100

●▲■

●■

1000

●▲■

●■

10000

●▲

●▲■

●■

●■

100000

●▲

●▲

●:平皿法(供試液體積:1mlㄍ皿);

▲:平皿法(培養基稀釋法供試液體積:<1mlㄍ皿);

■:薄膜過濾法(供試液體積可以比較靈活)。

10.6.2 供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。使用滅菌用具時,不能接觸可能污染的任何器物,滅菌吸管不得用口吹吸。

10.6.3 供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1h。否則,可能導致微生物繁殖或死亡而影響計數結果。

10.6.4 供試液稀釋及注皿時應取均勻的供試液,以免造成實驗誤差。

10.6.5 為避免細菌菌落蔓延生長,宜采取下列方法處理:

10.6.5.1 開蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板開蓋,倒置斜放于凈化工作臺上,開機1~2h后合蓋,放入培養箱培養。

10.6.5.2 換陶瓦蓋 將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。

10.6.5.3 加TTC 于傾注培養基前,在每1000ml營養瓊脂內加入滅菌1%TTC溶液1ml(最終濃度為0.001%),混勻后傾注平皿。

11 檢驗報告書寫

本品按《中國藥典》2010年版微生物限度檢查法標準檢驗,結果符合或不符合規定。

表4 細菌、霉菌、酵母菌形態特征比較(營養瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板)

菌落形態

細菌

霉菌

酵母菌

大小

差別很大,在同一平板上可出現針尖大小至大于10mm菌落

一般較大,亦有細小的菌落。在同一平板上生長的菌落大小有時不一致

多數直徑為1~2mm,在同一平板上生長的菌落大小有時不一致

外觀形態

多樣,小而突起或大而扁平

多為圓形,有的蔓延生長為無定形

培養基表面生長者多為圓形,內層生長者為圓形、鐵餅、紡錘或三角形

色澤

白、灰白或無色,亦有淡褐、淡黃及淡紅色,菌落正反面顏色相同

小菌落灰白,大菌落形成孢子后顏色多樣。菌落正反面顏色不同

乳白或粉紅色多見,在同一平板上色調較單一

透明度

透明或不透明

小菌落半透明有明顯折光性,大菌落不透明

透明較差

邊緣

整齊或不整齊。有放射線狀、樹枝狀、鋸齒狀、卷發狀。低倍鏡下一般見不到邊緣

菌絲體構成,多呈放射狀

整齊、低倍下可見球狀.卵圓狀或假菌絲狀.細胞細密排列

氣味

一般有臭味

往往有霉味

多帶酒香味

與培養基結合

不結合

結合較牢固,不易挑起

不結合,易挑起

生長速度

一般很快

較慢

較快

形態

球或桿狀,細小均一。高倍鏡或油鏡下可觀察形態

菌絲體相互交織.成熟霉菌常有產孢組織及孢子

多數為圓或卵圓形,常有芽體相連

排列

單個、分散或有一定的排列方式

絲狀交織

單個分散

二、控制菌檢查

l 簡述

控制菌檢查是用于檢查某些特定微生物(控制菌或其他致病菌),規定按一次檢出結果為準,不再復試。

由于控制菌檢查為一次性報告實驗結果,故應注意方法的有效性確證(方法驗證或陽性對照)、實驗過程保障和結果確證,以提高檢驗結果的可靠性。既要避免漏檢造成的假陰性結果。也要避免實驗室污染造成的假陽性結果。

控制菌檢查中,涉及實驗室監控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、方法驗證試驗中的陽性菌操作等,應在專門的陽性菌實驗室進行。除另有規定外,陽性菌實驗室應符合國家Ⅱ級生物安全標準,陽性菌實驗室應配備生物安全柜。陽性菌操作不得在供試品檢驗用潔凈實驗室內進行。

2 方法驗證

在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果的準確性時,應對供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進行驗證。驗證時.按各供試品微生物限度項下的規定(給藥途徑)選擇相應的菌株,并按供試液的制備和控制菌檢查法所規定的方法進行。

2.1 儀器、設備及用具

見各控制菌檢查項下。

2.2 試液、指示液

見各控制菌檢查項下。

2.3 培養基

見各控制菌檢查項下。

2.4 方法驗證用標準菌株

應根據具體品種項下的目標控制菌選擇相應的驗證用標準菌株,常用目標控制菌的標準菌株如下:

大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]

乙型副傷寒沙門菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]

生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]

白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]

菌液制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌培養物少許,接種至l0ml營養肉湯培養基內,置30~35℃培養18~24h,取均勻培養物1ml,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1ml含菌10~100cfu的菌懸液,其菌數在做對照試驗的同時用營養瓊脂注皿或平板涂布,經培養后計數確定。生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養基中,置30~35℃培養18~24h,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。

2.5 供試液的制備(見細菌、霉菌及酵母菌計數)

2.6 驗證方法

2.6.1 試驗組取規定量供試液和10~100cfu試驗菌加入增菌培養基中,按相應控制菌的檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,沖洗后,取出濾膜接至增菌培養基中。

2.6.2 陽性對照 取10~100cfu試驗菌加入增菌培養基中,按相應控制菌的檢查法進行檢查。

2.6.3 陰性對照取相應的稀釋液替代供試液,按相應控制菌的檢查法進行檢查。

2.7 結果判定

陽性對照組應檢出試驗菌,陰性對照組應無菌生長。若試驗組檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應建立新的方法,消除供試品的抑菌活性,并重新驗證。

驗證試驗可與供試品的控制菌檢查同時進行。

(一)大腸埃希菌

1 簡述

大腸埃希菌(Escherichia coli)即大腸桿菌,為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外,新近發現有非脫羧埃希菌等5個種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內的棲居菌,隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌。表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染,即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌,可引起嬰幼兒、成人爆發性腹瀉。為保汪人體健康,口服藥品必須檢查大腸埃希菌。

用4-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)和靛基質(indole)試驗檢查大腸埃希菌是一項新技術,其檢驗步驟為:增菌培養后,轉種MUG蛋白胨培養基培養,多數情況下不需要從混合菌中分離單個菌,如MUG、Indole試驗為陽性或陰性即可報告結果。

原理:利用目標菌限定酶作用的底物的水解產物,產生顏色或熒光反應作為指示系統來鑒定目標菌。

實驗證明96%的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUD),約10%的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解,產生熒光,由于熒光反應的敏感度較顏色反應強千萬倍,易于觀察,沒有主觀性,因而用MUG鑒定大腸埃希菌已被廣泛應用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。單一的MUG鑒別大腸埃希菌其漏檢率達6%,鑒于98%的大腸埃希菌基靛基質試驗為陽性,故將MUG與靛基質試驗結合,比單用MUG可提高大腸埃希菌的檢出率。如MUG與Indole試驗的反應不一致時,則需將供試液的增菌培養物用EMB瓊脂平板分離培養、革蘭染色、鏡檢及生化試驗鑒別。該法理論上可使大腸埃希菌的檢出率達98%。

如僅用IMViC生化試驗來鑒別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌,專屬性不強。

2 儀器、設備及用具(參照細菌、霉菌及酵母菌計數)

3 試液指示液

3.1 0.9%無菌氯化鈉溶液(附件二3.1)

3.2 無菌磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)(附件二3.3)

3.3 無菌對氨基苯甲酸溶液(附件二2.2)

3.4 無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液(附件二3.2)

3.5 靛基質試液(附件二2.17)

3.6 甲基紅試液(附件二4.2)

3.7 V-P試液(附件二2.11,2.13)

3.8 革蘭染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.9 中性紅指示液(附件二4.1)

3.10 亞甲藍指示液(附件二4.3)

3.11 溴麝香草酚藍指示液(附件二4.6)

3.12 酸性品紅指示液(附件二4.7)

3.13 曙紅鈉指示液(附件二4.9)

4 培養基

4.1 營養肉湯(附件二5.1)

4.2 營養瓊脂(附件二5.2)

4.3 膽鹽乳糖(BL)培養基(附件二5.6)

4.4 4-甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養基(附件二5.7)

4.5 乳糖發酵培養基、乳糖膽鹽發酵培養基、5%乳糖培養基(附件二5.21,5.22)

4.6 蛋白胨水培養基(附件二5.18)

4.7 磷酸鹽葡萄糖胨水培養基(附件二5.19)

4.8 枸櫞酸鹽培養基(附件二5.20)

4.9 曙紅亞甲藍(EMB)瓊脂(附件二5.8)

4.10 麥康凱瓊脂(附件二5.9)

5 準備

5.1 對照用菌液(見方法驗證)

5.2 供試品的檢驗量(見細菌、霉菌及酵母菌計數5.3)

5.3 供試液的制備(見細菌、霉菌及酵母菌計數)

6 操作步驟

6.1 檢驗程序

陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時,應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10~100cfu,供試品和增菌培養基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

陰性對照試驗 取稀釋劑10m1加入100ml(或200 m1)相應控制菌檢查用的增菌培養基中,培養,應無菌生長。

6.2 增菌培養 取膽鹽乳糖(BL)培養基3瓶,每瓶各100ml。2瓶分別加入規定量的供試液(相當于供試品1g、lml、10cm2),其中1瓶加入對照菌10~100個作陽性對照,第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。培養18~24h,必要時可延至48h。陰性對照應無菌生長。

取上述培養物0.2ml,接種至含5ml MUG培養基的試管內,培養,于5、24h在366nm紫外光下觀察,同時用未接種的MUG培養基作本底對照。在紫外光下若管內培養物呈現藍白色熒光,為MUG陽性;不呈現熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質陽性;呈試劑本色,為靛基質陰性。本底對照的MUG和靛基質試驗應為陰性。如MUG陽性、靛基質陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性、靛基質陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌。

6.3 分離培養如呈現MUG陽性、靛基質陰性或MUG陰性、靛基質陽性時,應將上述供試品BL增菌培養液輕輕搖動,以接種環沾取1~2環培養液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上。培養18~24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表1所列的菌落形態特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。

表1 大腸埃希菌菌落形態特征

培養基

菌落形態

曙紅亞甲藍瓊脂

呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心,圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤,常有金屬光澤

麥康凱瓊脂

鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤

當陽性對照的平板呈典型菌落生長時,若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1所列菌落形態特征相符或疑似者,應挑取可疑菌落進行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗,確認是否為大腸埃希菌。

為了規范操作,以下是對藥典要求的補充。

6.4 純培養 如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1所列特征相符或疑似者,以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心,沾取培養物,應挑選2~3個以上疑似菌落,分別接種營養瓊脂斜面,培養18~24h,作以下檢查。

如平板上無單個可疑菌落,但有可疑菌團(紫黑色,或有金屬光澤),應沾取可疑菌團培養物少許,或重新取增菌培養液劃線接種于EMB瓊脂平板,培養18~24h,再挑選單個疑似菌落,純培養,作以下檢查。

6.5 革蘭染色、鏡檢

6.5.1 以接種環沾取無菌水于潔凈載玻片上,取上述疑似菌落的營養瓊脂斜面新鮮培養物少許,制成均勻涂片,自然或微溫,再通過火焰2~3次干燥使固定。

6.5.2 滴加結晶紫染液,染色1min,水洗。

6.5.3 滴加碘液,媒染1min,水洗,以濾紙吸干余水。

6.5.4 滴加95%乙醇,脫色20~30s,至流出液無色,水洗。

6.5.5 滴加沙黃染液,復染1min,待干后,鏡檢。

6.5.6 染色結果

革蘭陽性菌呈藍紫色;革蘭陰性菌呈紅色。

大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌,或球桿菌狀,亦有桿菌狀。

6.5.7 注意事項

6.5.7.1 玻片必須潔凈,無劃痕。涂片的菌量宜少,菌液不可過濃。否則,菌細胞成堆或連成片。染色反應難于判斷,不利菌細胞的形態觀察。

如菌液過濃,須再取潔凈載玻片進一步稀釋。

6.5.7.2 培養物的菌齡以16~24h為宜。培養時間過長的革蘭陽性菌易染成紅色。

6.5.7.3 脫色是關鍵。脫色時間不足,菌細胞易染成陽性;脫色時間過長,菌細胞易染成陰性。

7 生化試驗

7.1 乳糖發酵試驗 取上述斜面培養物,接種于乳糖發酵管,培養24~48h,觀察產酸(指示劑為酸性品紅者為紅色;指示劑為溴麝香草酚藍者為黃色),產氣(小倒管內有氣泡,氣泡無論大小都是產氣)。

為避免遲緩發酵乳糖產生假陰性,亦可接種5%乳糖發酵管。絕大多數遲緩發酵乳糖的細菌,可于24h出現陽性?;蜻m當延長培養時間。

7.2 靛基質試驗(Ⅰ) 取上述斜面培養物,接種于蛋白胨水培養基,培養24~48h,沿管壁加入靛基質試液數滴,輕輕搖動試管,液面呈玫瑰紅色為陽性,呈試劑本色為陰性。98%的大腸埃希菌靛基質試驗為陽性。一般24h即可出現陽性結果,以無菌操作先從管中取出1或2ml培養液進行檢查,如靛基質是陰性,余下的蛋白胨水培養物再培養24h,作靛基質試驗。

7.3 甲基紅試驗(M) 取上述斜面培養物,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中,培養48±2h,于培養液中加入甲基紅指示液2~3滴(約每ml培養液加指示液1滴),輕微搖動,立即觀察,呈鮮紅色或橘紅色為陽性,呈黃色為陰性。

7.4 乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P) 取上述斜面培養物。接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中,培養48±2h,于2ml培養液中加入α-萘酚乙醇試液1ml,混勻,再加40%氫氧化鉀試液0.4ml,充分振搖,在4h(通常在30min)內出現紅色應判為陽性,無紅色反應為陰性。

7.5 枸櫞酸鹽利用試驗(C) 取上述斜面培養物,接種于枸櫞酸鹽培養基斜面上,培養2~4天,培養基斜面有菌苔生長,培養基由綠色變為藍色時為陽性,培養基顏色無改變、無菌生長為陰性。

8 結果判斷

8.1 當陰性對照試驗呈陰性,陽性對照試驗MUG呈陽性,供試品MUG陽性、靛基質陽性,報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。MUG陰性、靛基質陰性,報告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。

8.2 MUG陽性、靛基質陰性、IMViC試驗為-+、革蘭陰性桿菌,報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌;MUG陰性、靛基質陽性、IMViC試驗為++、革蘭陰性桿菌,報告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。

8.3 供試品培養物檢查不符合8.2二項中的任一項,報告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。

8.4 當陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸埃希菌,不能做出檢驗報告。

9 注意事項

9.1 MUG法不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外,尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株;以及少數革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌,其MUG為陽性。因此,在MUG培養基成分中增加了去氧膽酸鈉的量,可排除革蘭陽性菌的干擾。在膽鹽乳糖培養基中志賀菌、沙門菌較難生長。

9.2 配制MUG培養基時,務必校正pH值,滅菌后pH不得過7.4,否則pH值偏高,MUG分解,本身則顯熒光;分裝MUG培養基的試管應挑選,試管、蛋白胨不得顯熒光。

9.3 培養時間 供試品培養液接種于MUG培養基中,一般培養5h和24h要觀察是否產生熒光,如熒光很微弱,不能準確判斷時,可延長培養至48h再觀察結果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同,對底物和底物的濃度反應的差異;培養基中選擇因子的影響;培養時問、溫度;pH值的改變;大量競爭菌和樣品本身物質成分的干擾等,對結果的判斷亦有影響。

9.4 結果觀察 取供試品的MUG試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在366nm紫外光燈下觀察,陽性對照管應有較強的藍白色熒光,陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光,應仔細觀察比較,或將各管調換位置(陰性管居中),適當傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈,影響供試品管與陰性對照管的觀察時,亦可移去陽性對照管。

9.5 藥品中污染的大腸埃希菌,易受生產工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態特征時有變化,挑取可疑菌落往往憑經驗,主觀性較大,務必挑選2~3個以上菌落分別做IMViC試驗鑒別,挑選菌落越多,檢出陽性菌的機率越高,如僅挑選一個菌落做IMViC試驗鑒別.則易漏檢。

9.6 在IMViC試驗中,以滅菌接種針沾取菌苔,首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上,然后接種于蛋白胨水培養基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中。切勿將培養基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上,以免產生假陽性結果。

根據試驗資料,發現某些菌培養3天后,構櫞酸鹽利用試驗產生陽性,故僅培養2天是不夠的,枸櫞酸鹽利用試驗培養時間可延長至4天。

9.7 以IMViC試驗來判斷大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含混的。IMViC試驗為++者,除大腸埃希菌外,還有非活躍大腸埃希菌(E.coli jnactive)、弗格森埃希菌(E.fergusonii)、赫爾曼埃希菌(E.hermanii)。IMViC試驗為-+者,除大腸埃希菌外,還有非活躍大腸埃希菌(E.coli inactive)、傷口埃希菌(E.vulneris)、蟑螂埃希菌(E.blattae)。

9.8 陽性對照試驗是檢查供試品是否有抑菌作用及培養條件是否適宜。陽性對照菌液的制備、計數及加入含供試品的培養基中等操作,不能在檢測供試品的潔凈實驗室或凈化臺上進行,必須在單獨的隔離間或凈化臺操作,以免污染供試品及操作環境。

9.9 在各類供試品中檢測大腸埃希菌及其他控制菌,按一次檢出結果為準,不再抽樣復驗。檢出的大腸埃希菌及其他控制菌培養物須保留1個月,備查。

(二)大腸菌群

1 簡述

大腸菌群(Coliform)是指37℃生長時能發酵乳糖,在24小時內產酸產氣的革蘭陰性無芽孢桿菌。符合上述定義的細菌除大腸埃希菌屬(Escherichia)的多數菌外,還包括腸桿菌科的腸桿菌屬(Enterobacter)、枸櫞酸菌屬(Citrobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)的多數菌。大腸菌群包括了正常人畜腸道內需氧的的大多數革蘭陰性桿菌。以大腸菌群作為衛生指示菌比控制大腸埃希菌具有廣泛的衛生學意義,檢查方法簡便。因此,國際上以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛生指示菌,對衛生質量的要求更嚴格。

大腸菌群的檢查通過增菌、分離、革蘭染色、鏡檢和確證試驗等步驟。

2 儀器、設備及用具(見大腸埃希菌檢查法)

3 試液、指示液(見大腸埃希茵檢查法)

4 培養基

4.1 乳糖發酵培養基(附件二5.21)

4.2 乳糖膽鹽發酵培養基(附件二5.22)

4.3 曙紅亞甲藍(EMB)瓊脂(附錄5.8)

4.4 麥康凱瓊脂(附錄5.9)

5 對照用菌液(大腸埃希菌,同控制菌方法驗證2.4)

6 操作步驟

6.1 操作程序

6.2 增菌培養 取乳糖膽鹽發酵管3支,分別加入1:10稀釋的供試液1ml(含供試品0.1g或0.1m1)、1:100稀釋的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)和1:1000稀釋的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)。另取1支乳糖膽鹽發酵管,加入稀釋劑1ml作為陰性對照。均培養18~24h,觀察結果。

加供試液的乳糖膽鹽發酵管若無菌生長、或有菌生長但不產酸產氣,則判該管未檢出大腸菌群。若乳糖膽鹽發酵管產酸產氣,應進一步分離培養。

6.3 分離培養 將上述產酸產氣的發酵管中的培養物,分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上,培養18~24h。

大腸菌群的菌落在曙紅亞甲藍瓊脂培養基平板上呈紫黑色或紫紅色,圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤;在麥康凱瓊脂培養基的平板上呈鮮桃紅色或粉紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤。若平板上無菌落生長,或生長的菌落與上述菌落特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌,判該管未檢出大腸菌群;若平板上生長有疑似菌落,且為革蘭陰性無芽孢桿菌,應進行確證試驗。

6.4 確證試驗 從上述分離平板上挑選4~5個疑似菌落,分別接種于乳糖發酵管中,培養24~48小時。若產酸產氣,判該乳糖膽鹽發酵管檢出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群。

6.5 結果判斷 根據大腸菌群的檢出管數,按表2報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數。

表2 大腸菌群MPN(Most probable number)表

各供試品量的檢出結果

最可能的大腸菌群數N

(個ㄍg或ml)

1.0g或1.0ml

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

>102

10<N<102

1<N<10

<1

注:+ 檢出大腸菌群。- 未檢出大腸菌

7 注意事項

7.1 加供試液的乳糖膽鹽發酵管,由于有的藥渣顏色較深或沉淀物較多,干擾結果的觀察。應仔細觀察倒管底部或試管壁、培養液表面有無氣泡。針尖大的氣泡也是產氣。

7.2 乳糖膽鹽發酵培養基內的倒管不小于30mm×3mm(內徑)。否則,倒管被藥渣遮擋,不便觀察結果。

7.3 加供試液的乳糖膽鹽發酵管,經培養后,其倒管內無論產氣多少,均應做分離培養,革蘭染色、鏡檢。如產氣太少,可延長培養時間。

7.5 盡可能多挑選曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基平板上大腸菌群的可疑菌落,做乳糖發酵確證試驗。挑可疑菌落越多,可提高大腸菌群檢出率。

(三)沙門菌

1 簡述

沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌,按《Bergey系統細菌學手冊》第一卷(1984),沙門菌分5個亞屬,2003年出版的第八版的《臨床微生物手冊》將沙門菌屬分成兩個菌種及腸炎沙門菌和乍得沙門菌,其中的腸炎沙門菌分6個亞屬,包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒,豬霍亂等沙門菌在內,當時已發現2501個血清型。O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95%,所以用沙門菌A-FO多價血清進行沙門菌初篩試驗。藥品中的沙門菌,是以鑒定沙門菌屬為準,即對每10g(或10m1)藥品中是否檢出沙門菌作出檢驗報告。

由于沙門菌血清型繁多,各血清型的生化及血清學特性雖密切相關,卻不盡相同,采用一種增菌培養基和兩種分離培養基,不可能涵蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件。此外,由于藥品在生產過程中,常受到加熱、干燥等加工步驟的影響,藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態,故須在增菌培養前先進行預增菌,然后再進行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、血清學試驗等步驟。

2 儀器、設備及用具(見大腸埃希菌檢查法2)

3 試液指示液(參見大腸埃希菌檢查法3)

3.1 無菌脲試液(附件二2.5)

3.2 酚磺酞指示液(附件二4.4)

3.3 亮綠試液(附件二2.9)

3.4 氰化鉀試液(附件二2.14)

3.5 溴甲酚紫指示液(附件二4.5)

3.6 革蘭染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.7 沙門菌屬A~F“0”多價血清(0多價1)。

4 培養基

4.1 營養瓊脂培養基(附件二5.2)

4.2 營養肉湯培養基(附件二5.1)

4.3 半固體營養瓊脂培養基(附件二5.3)

4.4 曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)(附件二5.8)

4.5 麥康凱瓊脂培養基(MacC)(附件二5.9)

4.6 四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)(附件二5.11)

4.7 三糖鐵瓊脂培養基(TSI)(附件二5.10)

4.8 膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL)(附件二5.13)

4.9 沙門菌扁志賀菌屬瓊脂培養基(S.S)(附件二5.12)

4.10 蛋白胨水培養基(附件二5.18)

4.11 脲(尿素)瓊脂培養基(附件二5.23)

4.12 氰化鉀培養基(附件二5.24)

4.13 賴氨酸脫羧酶培養基(附件二5.25)

5 對照用菌液

取乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B) 50094]的培養物少許,接種至10ml營養肉湯培養基內。30~35℃培養18~24h后,用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當于10~100cfuㄍml,作陽性對照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計數法測得。

6 操作方法

6.1 準備工作:[見細菌、霉菌(酵母菌)計數6 ]

6.2 增菌培養

6.2.1 預增菌取營養肉湯培養基3份,每份200ml,1份加入10g或者10ml供試品,混勻;1份加入供試品及陽性對照菌10~100cfu,混勻;1份加入稀釋劑10ml作陰性對照,30~35℃培養18~24h后觀察。搖動陰性對照瓶后應清亮透明,無菌生長。

6.2.2 增菌培養 輕微搖動供試品增菌培養瓶及陽性對照瓶,分別吸取1ml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養基的試管中,培養18~24h。

6.3 分離培養輕微搖動供試品增菌培養瓶及陽性對照瓶,分別以接種環沾取1~2環培養液接種于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂(SS)平板及曙紅亞甲藍(EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個,倒置培養24~48h,必要時延長至40~48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態特征見下表。

表3 沙門菌的菌落特征

平板

菌落形態

膽鹽硫乳瓊脂(DHL)

無色至淺橙色.半透明,菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色

沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S)

無色至淡紅色,半透明或不透明,菌落中心有時帶黑褐色

曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)

無色至淺橙色,透明或半透明,光滑濕潤的圓形菌落

麥康凱瓊脂(MacC)

無色至淺橙色,透明或半透明,菌落中心有時為暗色

由于沙門菌不發酵乳糖和蔗糖,不產酸,菌落不著色,一般為無色半透明,多數沙門菌因產生H2S,菌落中心呈現黑色甚至全黑色,在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上,H2S特征有時不明顯,沙門菌屬亞屬III因多數菌株發酵乳糖,故在上述平板上的乳糖發酵菌落呈現粉紅或紫色,但由于產生H2S,在有H2S指示系統的平板上仍出現黑色中心。在上述培養基上,有些非沙門菌屬細菌,也可呈現類似沙門菌菌落形態,須進一步鑒別。由于藥物的影響或非典型菌株的存在,沙門菌菌落可呈現非典型形態,如色澤變深,菌落粗糙等,應注意辨別。

6.4 初步鑒別試驗

從每個供試品的分離平板上挑取2~3個疑似菌落(菌落形態特征與表3所列的形態特征相符或疑似)分別接種于三糖鐵瓊脂斜面,接種時應以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位,沾取培養物劃線于三糖鐵瓊脂斜面(或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面)并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面,培養18~24h,觀察結果。

疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應為:①斜面紅色(產堿),底層黑色(產H2S)并顯示黃色(產酸);②斜面紅色,底層黃色;③斜面黃色,底層黑色,并顯示黃色。多數沙門菌在三糖鐵瓊脂上產生氣體,使底層瓊脂出現氣泡或使瓊脂斷裂,但也有不產生氣體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色,斜面未見紅色底層未見黃色,或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。

將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養瓊脂斜面培養物作生化試驗,血清凝集試驗及革蘭染色,鏡檢。沙門菌應為革蘭陰性桿菌。

6.5 生化試驗

6.5.1 靛基質試驗 用接種環沾取少許培養物,接種到蛋白胨水培養基中,照大腸桿菌檢查法靛基質試驗項下操作、判斷結果。沙門菌應為陰性反應。

6.5.2 脲酶試驗 用接種環沾取少許培養物,劃線接種于脲瓊脂斜面,培養24h,觀察結果。斜面變為紅色為陽性反應,沙門菌屬為陰性反應。

6.5.3 氰化鉀試驗 將培養物先接種至營養肉湯培養基中培養20~24h,用接種環沾取培養液1環,接種至氰化鉀培養基內,另取一環培養液接種于不含氰化鉀的同樣培養基內作對照管,接種后即以橡膠塞塞緊,培養24~48h,觀察結果。對照管內有菌生長(混濁),而試驗管也有菌生長為陽性反應;對照管有菌生長(混濁)而試驗管無菌生長(清亮)為陰性反應。沙門菌應為陰性反應。

本試驗應十分注意密封管口,夏天分裝培養基宜在冰浴中進行,防止氰化鉀分解,產生氫氰酸逸出,致使培養基內氰化鉀濃度降低,不能抑制細菌生長,造成假陽性。

氰化鉀為劇毒品、操作時須謹慎,切勿用口吸液。用后的培養基每管加數粒硫酸亞鐵和20%氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌。

6.5.4 賴氨酸脫羧酶試驗用接種環沾取少許培養物,接種在賴氨酸脫羧酶培養基中,同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養基作為對照管,培養24~48h觀察結果。對照管黃色(產酸),試驗管呈紫色為陽性反應(賴氨酸脫羧產堿);試驗管黃色為陰性反應。沙門菌應為陽性反應。

6.5.5 動力試驗用接種針沾取培養物,穿刺接種于半固體營養瓊脂管中,培養24h,觀察結果。有動力的細菌能在穿刺線以外的培養基內擴散生長使培養基呈混濁現象;無動力的細菌僅能沿穿刺線生長,不向外擴散,培養基仍呈清晰透明狀;無動力表現的培養物,應在室溫保留2~3天后,再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外,均具有周身鞭毛,能運動,動力試驗陽性。沙門菌生化反應的初步鑒別見下表。

表4 沙門菌與有關細菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗的鑒別

序號

靛基質

脲酶

氰化鉀

賴氨酸脫羧酶

判定菌屬

斜面

底層

產氣

硫化氫

1.1

+/-

+/-

沙門菌屬

1.2

+/-

沙門菌屬III

2

+/-

緩慢愛德華菌屬

3

+/-

+/-

+/-

-/+

-/+

+/-

弗勞地檸檬酸桿菌

4.1

+S

奇異變形桿菌

4.2

+/-S

普通變形桿菌

5

+/-

+/-

+/-

+/-

大腸埃希菌

6

-/+

志賀菌屬

7.1

+/-

陰溝腸桿菌

7.2

+/-

肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌

8

+S/-

+/-

普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬

9

+/-

-/+

蜂房哈夫尼亞菌、黏質沙雷菌

針對三糖鐵瓊脂上的反應,+產酸(黃色),陽性,陽性率,>90%;-產堿(紅色),陰性,陰性率,>90%;+/-多數陽性、少數陰性;+S產生少量氣體;生化試驗的結果參見本章6.5內容;+陽性,陽性率,>90%;-陰性,陰性率,>90%;+/-多數陽性、少數陰性,-/+多數陰性、少數陽性(本表依據何曉青衛生防疫細菌檢驗,參考第八版《美國臨床微生物手冊》,反應序號1除典型反應外,脲酶、氰化鉀試驗、賴氨酸脫羧酶試驗三項中有一項異常;反應序號2僅靛基質陽性;可結合血清學凝集試驗,或加做部分生化試驗,判定是否為沙門菌,其他情況可排除沙門菌。

6.6 血清學凝集試驗

6.6.1 準備1片潔凈的滅菌載玻片,在近中央的一端,以直徑3mm接種環沾取沙門菌屬0多價1血清2~3環制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹,長約1.5cm,寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作,作為陰性對照。

6.6.2 用接種環分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養瓊脂斜面的新鮮培養物少許,在血清和鹽水中混勻。菌量要適當,勿過濃。

6.6.3 將玻片前后傾斜數次,以暗色背景襯底,在良好的照明條件下進行觀察,陰性對照不出現凝集現象,試驗組任何程度的凝集現象都是陽性反應。陽性反應通常在3min內發生。有時因血清效價低、反應遲緩時,應將玻片置培養皿內,并放一個濕棉球在旁邊,蓋上皿蓋,經約20min,再觀察結果。如果仍然沒有出現凝集,應取斜面培養物,置含少量生理鹽水的試管中,制成濃菌懸液,在100℃水浴中保溫30min,以除去可能存在的Vi抗原,待冷,再做凝集試驗,如出現凝集,仍判為陽性反應;如不出現凝集現象,則為陰性反應。

6.6.4 如對照試驗出現凝集現象為非特異反應,須對該菌株培養物進行處理后再作凝集試驗。

7 結果判斷

7.1 供試品培養物為革蘭陰性桿菌,三糖鐵瓊脂反應及生化反應符合沙門菌屬反應,沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陽性反應(含待檢培養物經l00℃30min處理后凝集試驗為陽性反應),報告10g或10ml供試品檢出沙門菌。

7.2 供試品培養物三糖鐵瓊脂反應或生化反應不符合沙門菌屬反應及沙門菌屬0多價1血清凝集試驗為陰性反應(含待檢培養物經100℃30min處理后凝集試驗為陰性反應),報告1g或1ml供試品未檢出沙門菌。

7.3 供試品培養物出現下列情況應繼續鑒定或保留菌種送交有關單位進一步鑒定后,再作報告。

7.3.1 供試品培養物生化反應符合沙門菌屬反應,沙門菌屬0多價1血清凝集試驗陰性反應。

7.3.2 供試品培養物生化反應不符合沙門菌屬反應,沙門菌屬0多價1血清凝集反應呈陽性反應。

7.4 對已檢出沙門菌的供試品分離菌種,有條件者,應進一步作菌型鑒定。根據檢出菌的特性,推斷可能菌型,增加生化試驗項目及沙門菌單因子血清“O”及“H”凝集試驗進行鑒定。

8 注意事項

8.1 試驗用培養基,需經過質量鑒定,用已知典型反應菌株(如乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B) 50094]進行測試,其靈敏度及特征性反應應符合要求。培養基需在規定條件保存,在規定時間內使用。分離平板在使用前應置30~35℃溫箱內倒置孵育1~2h,使其表面溫暖濕潤,利于分離沙門菌。

8.2 在對供試品進行測試的同時,需做陽性菌對照及陰性對照。陰性對照應無菌生長,陽性對照應顯示陽性結果,否則檢驗結果無效。在進行陽性菌對照試驗時,應與供試品檢驗分開操作,避免污染。特別是用接種環沾取菌液進行接種或分離時,避免動作過大,形成氣溶膠,污染供試品檢驗用具及操作環境。

8.3 為保證試驗方法的可靠性,對分離平板上的疑似菌落,應多選取幾個菌落同時進行試驗。挑取菌落時,不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落,而應在菌落分布稀疏部位挑選。

8.4 生化試驗及血清學試驗的被鑒定培養物必須是純培養物,否則,不可能得到正確結果。如遇血清學凝集試驗陽性而生化試驗不符合時,應首先檢查培養物的純度。對已污染的培養物,不應丟棄,因為污染菌可能掩蓋沙門菌,故應對被污染的培養物重新分離,仔細選取單個菌落再進行試驗。

8.5 所有生化反應均需按照規定的試驗要求進行,如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應的時間,應在24士2h,時間過短過長,都可能出現錯誤結果判斷。又如氰化鉀試驗,試管口應密塞,否則氰化鉀濃度降低,致使抑菌作用下降,產生錯誤的判定結果。

8.6 血清凝集試驗的影響因素甚多,除與電解質、pH、溫度有關外,須特別注意抗原與抗體用量的比例恰當,只有當二者濃度適當時,凝集反應方明顯可見。由于本法試驗用多價血清,其凝集力相對較弱,試驗用菌液量切不能過大。測試前,應用已知陽性菌測試以掌握適宜菌液濃度。

8.7 沙門菌為腸道重要致病菌,操作時應特別注意防止分離待檢菌及陽性對照菌對操作環境及試驗的污染。所有用過的增菌、分離、生化試驗培養基、血清學凝集試驗及染色鏡檢后的玻片等,均需經滅菌后方能洗滌。

(四)銅綠假單胞菌

1 簡述

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),習稱綠膿桿菌,為假單胞菌屬菌種,廣泛分布在土壤,水及空氣,人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在,故可通過環境和生產的各個環節污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷,眼科及其他外科疾患中常引起繼發感染,由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性,增加了治療的難度、國內外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養、革蘭染色鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。

2 儀器、設備和用具(見大腸埃希茵檢驗法2)

3 試液、指示液

3.1 0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液(附件二3.1,3.3)

3.2 1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液(附件二2.1)

3.3 鹽酸試液(附件二2.12)

3.4 三氯甲烷(附件二1.57)

4 培養基

4.1 營養肉湯培養基(附件二5.1)

4.2 膽鹽乳糖(BL)培養基(附件二5.6)

4.3 營養瓊脂培養基(附件二5.2)

4.4 溴代十六烷基三甲胺(附件二5.14)

4.5 綠膿菌素測定用培養基(PDP瓊脂)(附件二5.26)

4.6 明膠培養基(附件二5.27)

4.7 硝酸鹽胨水培養基(附件二5.28)

5 對照用菌液

銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]營養瓊脂斜面培養物少許,接種至10ml營養肉湯培養基內,于30~35℃培養18~24h后,用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當于10~100個cfu/ml,作陽性對照用菌液。其菌液濃度可在做陽性對照實驗的同時用平板菌落計數法測得。

6 操作方法

6.1 供試品的取樣量[見細菌、霉菌(酵母菌)計數6]

6.2 供試液的制備[見細菌、霉菌(酵母菌)計數7]

6.3 增菌培養

取膽鹽乳糖培養基3份,每份100ml,1份加入1:10供試液10ml(相當于供試品1g或1ml);1份加入供試液及陽性對照菌;l份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。于30~35℃培養18~24h(必要時可延至48h)。陰性對照菌應無菌生長。

6.4 分離培養

輕輕搖動上述增菌培養液,以接種環取1~2環培養液(如有菌膜應挑取之),劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板,于30~35℃培養18~24h。銅綠假單胞菌在該培養基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊,光滑濕潤,呈灰白色,周邊略呈擴散現象,在菌落相鄰處常有融合現象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散,使培養基顯藍綠色,但亦有不產色素的菌株。菌落還有粗糙型和黏液型等,應注意挑選。

6.5 純培養

供試品分離平板生長6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時,以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心,沾取培養物,應挑取2~3個疑似菌落,分別接種營養瓊脂斜面,培養,作以下檢查。

6.6 革蘭染色鏡檢

6.6.1 革蘭染色(見大腸埃希菌檢查6.5)

6.6.2 鏡檢

銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌,單個,成對或成短鏈排列。

6.7 生化試驗

可用銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]做生化試驗的陽性對照株。

6.7.1 氧化酶試驗

取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內,以無菌玻璃棒挑取營養瓊脂斜面培養物少許,涂在濾紙上,隨即滴加1滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液,在30s內,紙片上的培養物出現粉紅色,逐漸變為紫紅色,即為氧化酶試驗陽性反應。若培養物不變色或僅顯粉色為陰性反應。

本試驗應注意:

(1)試驗菌落(苔)必須新鮮,陳舊培養物反應結果不可靠。

(2)試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸,不可用普通接種針(環)(白金材料除外)挑取菌(苔),否則易出現假陽性。宜用玻璃棒或木棒。

(3)試劑宜新鮮配制,放置過久,二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。

(4)反應需在有氧條件下進行,勿滴加試劑過多,以免浸泡培養物使之與空氣隔絕,造成假陰性反應。

(5)麥康凱、SS培養基等含糖培養基上的菌落不適于做氧化酶試驗,因為糖分解產酸抑制氧化酶活性。

6.7.2 綠膿菌素試驗

取營養瓊脂斜面培養物接種于綠膿菌素測定用培養基(PDP)斜面上,30~35℃培養24h后,觀察斜面有無色素,如有色素,在試管內加三氯甲烷3~5ml,以無菌玻棒攪碎培養基并充分振搖。使培養物中的色素完全萃取在三氯甲烷內。靜置片刻,待三氯甲烷分層,用吸管將三氯甲烷移至另一試管中,加入鹽酸試液(1mol/L)約1ml,振搖后靜置片刻,如在鹽酸液層內出現粉紅色、即為陽性反應,無粉紅色出現為陰性反應。本試驗可用未接種的PDP瓊脂培養基斜面作陰性對照,陰性對照試驗應當呈陰性。如培養基斜面無色素產生,應于室溫培養l~2天再按上法試驗。凡經再次檢驗,綠膿菌素試驗仍為陰性者應繼續以下試驗。

6.7.3 硝酸鹽還原產氣試驗

以接種環沾取少許營養瓊脂斜面培養物接種于硝酸鹽胨水培養基中,置30~35℃培養24h,觀察結果。如果在培養基內的小倒管中有氣體產生,即為陽性反應,表明該培養物能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。小倒管內無氣泡者為陰性反應。

6.7.4 42℃生長試驗

以接種環沾取少許營養瓊脂斜面培養物于0.9%無菌氯化鈉溶液中,制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養瓊脂斜面上,立即置41℃士1℃的恒溫水浴箱內,務使整個斜面浸沒在水浴中,培養24~48h,斜面如有菌苔生長者為陽性反應;無菌苔生長為陰性反應。

6.7.5 明膠液化試驗

以接種針沾取營養瓊脂斜面培養物少許,穿刺接種于明膠培養基中,穿刺深度應接近培養基的底部,于30~35℃培養24h。取出放入0~4℃冰箱內10~30min。如培養基呈溶液狀,即為明膠液化試驗陽性反應;如明膠呈凝固狀,為陰性反應。

本試驗應注意:

(1)本試驗接種前,培養基應為固態,否則需將培養基置冰箱內使之凝固后,再穿刺接種。

(2)試驗應同時設未接種細菌的陰性對照管,與試驗管同時培養并觀察結果。

7 結果報告

7.1 供試品培養物經證實為革蘭陰性桿菌,氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者,即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。

7.2 供試品培養物氧化酶試驗陽性,鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養物,綠膿菌素試驗陰性時,其硝酸鹽還原產氣試驗、42℃生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時,亦報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。

7.3 凡與7.1與7.2結果不符時,報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞茵。

8 注意事項

8.1 銅綠假單胞菌污染藥品后,因生產工藝和藥物的影響,在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態可產生非典型形態。為防止漏檢,在挑取疑似菌落時,宜取2~3個以上菌落,分別進行檢驗,以提高銅綠假單胞菌的檢出率。

8.2 綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征,但色素的產生受許多因素的影響,除菌株差異及變異外,培養條件是重要因素,溫度、培養基成分等皆可影響色素產生。培養基中瓊脂、蛋白胨等均應事先測試,選用適宜品牌,試驗時并用陽性菌株作對照試驗。

(五)金黃色葡萄球菌

1 簡述

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為葡萄球菌屬中的一種,廣泛分布于自然界??諝?、土壤、水及物品上,人和動物皮膚及與外界相通的腔道中,也經常有本菌存在。本菌可產生多種毒素及酶,這些毒性物質能引起局部及全身化膿性炎癥,嚴重時可發展成為敗血癥和膿毒血癥,是人類化膿性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力較強,干燥情況下能生存數月,80℃30min的條件下尚能存活,5%石碳酸或0.1%升汞溶液10~15min才會被殺死。

金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗等步驟進行。本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。

2 儀器、設備及用具(見大腸埃希菌檢查法2)

3 試液、指示液

3.1 0.9%無菌氯化鈉溶液或無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)(附件二3.1,3.3)

3.2 革蘭染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.3 無菌枸櫞酸鈉氯化鈉溶液(附件二2.7)

3.4 血漿的制備

以無菌注射器吸取滅菌的含5%枸櫞酸鈉的0.9%的氯化鈉溶液1ml,用無菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,輕輕混勻數分鐘。待血液不凝固時,徐徐放入滅菌離心管中,離心(500 r/min離心5min),分離血漿,用滅菌吸管將血漿轉移至滅菌試管中,置冰箱備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗陽性的金黃色葡萄球菌(如金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003])測試,證明血漿合格后,方可用于實驗。

3.5 1%酚磺酞指示液(附件二4.4)

4 培養基

4.1 營養肉湯培養基(附件二5.1)

4.2 營養瓊脂培養基(附件二5.2)

4.3 亞碲酸鹽肉湯培養基(附件二5.15)

4.4 卵黃氯化鈉瓊脂培養基(附件二5.16)

4.5 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(附件二5.17)

5 對照用菌液

取金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]營養瓊脂斜面新鮮培養物少許,接種至10ml營養肉湯培養基中,30~35℃培養18~24h,用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當于10~100cfu/ml,作陽性對照用菌液。其菌液濃度可在做陽性對照實驗的同時用平板菌落計數法測得。(見方法驗證用標準菌株2.4)

6 操作方法

6.1 供試品的檢驗量[見細菌、霉菌(酵母菌)計數6]

6.2 供試液的制備[見細菌、霉菌(酵母菌)計數7]

6.3 增菌培養

取營養肉湯(或亞碲酸鈉肉湯)培養基3份,每份100ml,1份加入10ml供試液,1份加入供試液及陽性對照菌,1份加入與供試液等量的0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液(pH7.2)作為陰性對照,置30~35℃培養18~24h(必要時可延至48h)。陰性對照應無菌生長。

6.4 分離培養將上述供試品增菌培養液,以接種環沾取1~2環培養液,劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上,置30~35℃培養24~72h。當供試品分離平板無菌落生長,或有菌落生長但不同于下表所列特征,可報告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

表5 金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養基上菌落形態特征

培養基

菌落形態特征

卵黃氯化納瓊脂

金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,光滑濕潤,外周有分解卵磷脂后產生的乳濁圈,菌落直徑1~2mm

甘露醇氯化納瓊脂

金黃色,圓形凸起,邊緣整齊.光滑濕潤.外周有黃色環。菌落直徑0.7~1mm

6.5 純培養

當供試品分離平板生長菌落與表1所列菌落特征相似或疑似時,應選取2~3個以上菌落,分別用接種針,輕輕沾取菌落中心表面培養物,接種于營養瓊脂斜面上,于30~35℃培養18~24h,取營養瓊脂斜面培養物作革蘭染色、鏡檢及接種營養瓊脂肉湯于30~35℃培養18~24h做血漿凝固酶試驗。

6.6 革蘭染色、鏡檢

6.6.1 革蘭染色(見大腸埃希菌檢查法6.5)

6.6.2 鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌,無芽孢,一般不產生莢膜。排列呈不規則的葡萄狀,亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。

6.7 血漿凝固酶試驗

試管法:取無菌試管(10mm×100mm)3支,各加入血漿和0.9%無菌氯化鈉溶液(1:1)0.5ml,1支加入瓊脂斜面培養物菌懸液(或被檢菌的營養肉湯培養液)0.5ml,其余2支作對照管:1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]培養物菌懸液或營養肉湯培養液0.5ml作為陽性對照;另一支加入營養肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。三管同時置37℃水浴或恒溫培養箱,3h后開始檢查,以后每隔適當時間觀察一次,直至24h。檢查時,輕輕將試管傾斜(動作勿大),仔細觀察,陰性對照管血漿流動自如,陽性對照管血漿呈凝固狀,試驗管呈凝固者為陽性反應;不凝固為陰性反應。陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時,應另制備血漿,重新試驗。

7 結果判斷

如果革蘭染色結果清晰可靠(必要時加做已知革蘭染色結果的細菌進行染色質量控制),凝固酶試驗陰性對照試驗呈陰性,陽性對照試驗呈陽性結果,供試品培養物按下列情況報告或處理:

7.1 疑似菌革蘭染色呈陽性球菌,血漿凝固酶試驗陽性反應者,報告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌(少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種)。

7.2 革蘭染色鏡檢不是革蘭陽性球菌,或血漿凝固酶試驗陰性反應,報告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

7.3 陰性對照有菌生長,試驗結果無效。

7.4 陽性對照試驗呈陰性結果,應當加做驗證試驗,考察檢品是否有抑菌活性。

8 注意事項

8.1 金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在,亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查,對非典型菌落也有必要進行凝固酶試驗做金黃色葡萄球菌的篩查,以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養基存放時間和培養時間影響色素產生,故培養基應新鮮配制。培養時間宜48h以上。

8.2 如果使用干燥培養基,應按說明書配制,注意pH值是否符合規定,必要時應校正pH后滅菌使用。

8.3 血漿凝固酶試驗應用新鮮培養物及新鮮血漿。如用陳舊培養物及血漿(纖維蛋白常已析出)易導致假陰性反應。此外,觀察結果時不要搖動試管,因凝固初期凝塊易破壞,引起假陰性試驗。

8.4 葡萄球菌屬在新版《Bergey手冊》中共收載為28種,在微生物菌種鑒定中目前應用較多的2003年出版的第八版《美國臨床微生物手冊》共收錄35個菌種,44個菌型。常見有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌3種??蓞⒄障卤磉M行鑒定。其中又以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鑒別最為重要。

表6 3種葡萄球菌的主要性狀

性狀

金黃色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

腐生葡萄球菌

菌落色素

主要為金黃色

主要為白色

主要為檸檬色

大?。ň渲睆剑?/p>

0.8~1.0mm

0.5~1.5mm

0.5~1.5mm

α溶血毒素

-/極少+

甘露醇

需氧

d

d

厭氧

凝固酶

卵黃反應

耐熱DNA酶

對新生霉素敏感性

S

S

R

噬菌體分型

多數能分型

不能分型

不能分型

A蛋白

致病性

弱或無

d結果不確定,S敏感,R耐藥

8.5 目前商品化的金黃色葡萄球菌檢測試劑多家微生物相關制劑公司有售,試劑具有較好的穩定性、準確性。商品化的檢測試劑應當在適當的條件下保存,在有效期內應用。

(六)梭菌

1 簡述

梭菌屬(Clostridium)過去稱為梭狀芽孢桿菌屬,菌體1um×5um左右的革蘭陽性桿菌,能形成芽孢。芽孢多大于菌體的寬度,細菌膨脹呈梭形,故名梭狀芽孢桿菌。該菌屬中主要病原菌有產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)和艱難梭菌(C.difficile),均能產生強烈的外毒素使人和動物致病。因此,對于某些用于陰道、創傷、潰瘍的藥品,必須控制梭菌。

檢查梭菌的方法主要是增菌產毒培養和鏡檢形態觀察,必要時做分離培養后再行鑒定。

2 儀器、設備及用具

2.1 玻璃器皿

試管(30mm×200mm)等。洗滌干凈,無殘留抗菌物質,包扎后,滅菌備用[見細菌、霉菌(酵母菌)計數]。

2.2 天平、離心機、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱[見細菌、霉菌(酵母菌)計數]。

2.2.1 天平、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱等應定期進行校驗。

2.2.2 厭氧培養袋、箱(罐)等(有商品供應),經測試后選用。

2.3 潔凈實驗室或凈化工作臺[見細菌、霉菌(酵母菌)計數2.1.1]。

2.4 手術鑷、手術剪及取樣匙,應嚴密包扎,滅菌備用。

3 試液

3.1 革蘭染色液(附件二2.10,2.16,2.4)

3.2 厭氧指示劑(附件二4.8)

3.3 3%過氧化氫溶液

3.4 75%乙醇溶液

3.5 碘酊溶液或碘伏

3.6 0.9%無菌氯化鈉溶液(附件二3.1)

3.7 苯扎溴銨(1:1000)溶液

4 培養基

4.1 硫乙醇酸鹽流體培養基(附件二5.33)

4.2 梭菌增菌培養基(附件二5.29)

4.3 哥倫比亞瓊脂培養基(含慶大霉素20mg/L和不含慶大霉素)(附件二5.30)

5 對照用菌液

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]。

菌液制備 取生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養基中,置30~35℃培養18~24h,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。生孢梭菌標準菌液計數可取每毫升含100~1000cfu的菌液0.1ml涂布于哥倫比亞瓊脂培養基平板置厭氧條件下培養48~72h計數;也可以取每毫升含10~100cfu的菌液1ml接種于不少于12ml硫乙醇酸鹽流體培養基中,搖勻,置30~35℃培養18~20h計數其中的燈籠狀菌團,一般情況下該燈籠狀菌團數與平板計數菌落數相當。[見方法驗證2.4]

生孢梭菌菌種的保存可取其硫乙醇酸鹽流體培養物混勻、凍存管分裝、超低溫保存(如-80℃),用時取出自然解凍、經硫乙醇酸鹽流體培養基復蘇、復壯,制備新鮮培養物使用。

6 操作方法

6.1 不同劑型樣品的前處理

6.1.1 散劑除去包裝,直接稱取規定量的樣品即可。

6.1.2 膠囊除去包裝,連殼一起稱取規定量樣品。

6.1.3 軟膏劑及栓劑稱取樣品10g,按細菌、霉菌、(酵母菌)計數6.23規定的適宜方法乳化,乳化后加入預熱至45℃的0.9%無菌氯化鈉溶液,制成1:20供試液。

6.2 增菌培養

6.2.1 厭氧培養裝置的準備除商品厭氧培養袋、箱、罐按使用說明要求準備外,實驗室亦可用真空干燥器、標本瓶或其他適宜容器替代使用,可選用下列一種方法制備厭氧條件:

6.2.1.1 冷觸媒法 臨用前,取試管或其他適宜容器3支,1支稱入硼氫化鈉0.22g(以厭氧培養容器容積1L計),1支稱取枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g,另1支放入經活化的鈀粒約1g,與接種后的供試品培養管(或平板)及厭氧指示劑管1支,同時置于厭氧培養容器內,隨即各加水5ml于前2支管(或容器)中,迅速密封容器蓋。鈀粒為覆蓋鈀的氧化鋁的球狀或條狀顆粒(有商品出售),用前需經160℃干烤2h,或在電爐上灼燒5min使其活化。由于每用1次便失去催化性,因此,再次使用時需按上法活化后方能使用。將鈀粒若干置室溫水中,附有大量氣泡者為活性良好,可直接使用。此法可作為鈀粒的活性檢查。

6.2.1.2 焦性沒食子酸法用前,取培養皿或其他適宜容器1支,加入焦性沒食子酸10g及無水碳酸鈉5g(以厭氧容器容積1L計),與接種后的供試品培養管(或平板)及厭氧指示劑管1支同時置于厭氧容器內,迅速密封容器蓋。

6.2.2 增菌培養 取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml)4份,其中2份置80℃保溫10min后迅速冷卻。上述4份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養基中,其中2份(直接1份,處理后1份)梭菌增菌培養管中分別加入陽性對照菌(10~100cfu)。置厭氧條件下培養48h。

6.3 分離培養取上述每一培養物0.2ml,分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養基平板上,置厭氧條件下培養48~72h。若供試品平板上無菌落生長,判供試品未檢出梭菌;若供試品平板上有菌落生長,應挑選2~3個菌落分別進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。

6.4 革蘭染色鏡檢取疑似菌落涂片,作革蘭染色、鏡檢,觀察染色及菌體特征。本菌形態特征較為典型。培養后形成的芽孢,初呈“火柴頭”狀卵圓形,繼而膨大呈球形,在菌體末端如鼓槌狀。培養時間至72h以上時,菌體可自溶而消失,僅見游離的芽孢囊,一般染色時呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢,大于菌體,著生于菌體中央、次端或頂端,為梭菌典型形態。

6.5 過氧化氫酶試驗 加一滴3%過氧化氫溶液至瓊脂表面的單個分散的菌落,或轉移至載玻片上的菌落上。有氣泡形成表示過氧化氫酶反應陽性,梭菌應成陰性結果??捎每莶菅挎邨U菌作為陽性反應對照菌。

7 結果判斷

若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌,有或無卵圓形或球形的芽孢。過氧化氫酶試驗陰性,判供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌。

8 注意事項

8.1 操作時勿損傷皮膚,若有損傷,應立即注射破傷風抗毒素,以防感染。

8.2 凡帶有活菌及毒素的器具,應在徹底滅菌后方可洗滌。

(七)白色念珠菌

1 簡述

白色念珠菌(Candida albicans)又名白假絲酵母菌(Saccharomyces albicaus)屬假絲酵母菌屬(Saccharomyces)。白色念珠茵是條件致病菌,是醫學全身性真菌感染病的重要組成之一,一旦感染,??梢鹦膬饶ぱ?、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。

白色念珠菌菌細胞呈圓形或卵圓形,直徑為3~6um,革蘭染色為陽性,但菌體著色不均勻,以出芽方式繁殖,在適宜的培養基上有芽生孢子及假菌絲生長,在假菌絲間其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌具有β-硝基半乳糖苷酶,可分解NGL,使對一硝基苯酚游離,在堿性條件下顯色。

白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中,目前國內外的藥品、食品標準已把白色念珠菌作為微生物檢驗中酵母菌的代表菌,因此有些藥品依據給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。

2 試驗器材及條件

2.1 設備及器皿

生化培養箱(23~28℃)、恒溫培養箱(30~35℃)、水浴鍋、顯微鏡、三角燒瓶、吸管、培養皿等。

2.2 標準菌株

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]。

菌液制備 取新鮮白色念珠菌菌種接種至10ml沙氏葡萄糖液體培養基中,30~35℃培養24~48小時,用0.9%無菌生理鹽水稀釋至含菌10~100cfu/ml。菌液可用沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板計數測定。

2.3 培養基

沙氏葡萄糖液體培養基(附件二5.35)

沙氏葡萄糖瓊脂培養基(附件二5.36)

念珠菌顯色培養基(法國CHROMAGAR公司)[附件二5.37]

1%聚山梨酯80-玉米粉瓊脂培養基(附件二5.38)

3 試驗操作

取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml、10cm2)直接或處理后接種至適量(不少于100m1)的沙氏葡萄糖肉湯培養基中,培養24~48 h。取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上,經30~35℃,培養24~48h(必要時延長至72h)。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色,表面光滑有濃酵母氣味,培養時間稍久則菌落增大,顏色變深、質地變硬或有皺摺。

若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符,判供試品未檢出白色念珠菌。

如平板上生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似,應挑選2~3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上,經30~35℃培養24~48h(必要時延長至72h)。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長,判供試品未檢出白色念珠菌。

4 確認試驗

若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色,挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上,培養24~48h。取培養物進行染色,鏡檢及芽管試驗。

芽管試驗 挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物,接種于加有一滴血清的載玻片上,蓋上蓋玻片,置濕潤的平皿內,置35~37℃培養1~3h,置顯微鏡下觀察,可見到由孢子長出短小芽管。

若上述疑似菌為非革蘭陽性菌,顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管,判供試品未檢出白色念珠菌。

三、培養基適用性檢查

1 概述

培養基質量是影響微生物檢驗結果的重要環節。計數測定用培養基的促生長能力是微生物限度檢查結果判斷的重要影響因素,控制菌檢查用培養基也可能由于其促生長能力、指示能力、抑制能力的差異,從而對菌落顏色、形態等指標存在較大差異,影響結果判斷的客觀性。

培養基適用性檢查是通過檢驗用培養基與對照培養基的比較,以陽性菌的生長狀態或特征來評價判斷檢驗用培養基是否符合檢驗要求。

微生物限度檢查用培養基主要分為細菌、霉菌及酵母菌計數測定用培養基和控制菌檢查用培養基兩部分。2010版《中國藥典》微生物限度檢查法中收載了“適用性檢查”對培養基質量進行控制。

2 培養基適用性檢查實驗的一般要求

2.1 培養基適用性檢查適用范圍

2010版《中國藥典》規定微生物限度檢查中成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基適用性檢查。

培養基適用性檢查試驗可用于確定實驗室所使用培養基(包括購置的不同批號的成品培養基、不同批號的脫水培養基干粉、按處方自行配制培養基所用不同批次的原材料等)、制備程序(包括水質控制、配制方法、滅菌程序等)、保存條件(溫度、濕度、時間及盛裝培養基的容器條件等)等是否滿足微生物限度檢查用要求。即上述影響培養基質量的各關鍵點應通過培養基適用性檢查試驗確定,如果其中有任一控制點發生變化應重新進行培養基適用性檢查。但是影響培養基質量的關鍵控制點的變化應掌握在微生物實驗室質量控制的一般原則內(見2.2),超過一般原則的培養基是否還能滿足微生物限度檢查用,無法通過培養基適用性檢查確定。

當檢驗結果出現異常,或實驗室質量控制需要,也可通過培養基適用性檢查提供一定依據。

總之,培養基適用性檢查是在正常條件下關于培養基質量的實驗室控制措施,并不一定在每次具體的微生物限度檢查樣品檢測試驗活動中都必須同時進行培養基適用性檢查試驗,但每次微生物檢查所用培養基均應經過適用性檢查。

2.2 微生物限度檢查用培養基質量控制的一般原則

2.2.1 不同處方培養基的替代使用不能通過培養基適用性試驗簡單確定。

2.2.2 培養基適用性檢查不能取代供應商或其他法定標準對培養基的有效期、保存條件、制備方法等的更嚴格的規定。

2.2.3 如果沒有特殊規定,培養基配制采用蒸餾水或純化水均可,但應采用一定措施加以檢測控制,如蒸餾水應核實pH是否為5~7;采用離子交換法制備的純化水,電阻值應不小于2MΩ等。

2.2.4 盡量臨用現配。培養基滅菌后在能取出的前提下,盡快取出,切忌在高壓鍋內過夜存留;固體培養基滅菌或融化后,融化狀態放置不得超過8h;一般預制培養基可置潔凈環境2~25℃保存,但不應超過21天;固體瓊脂培養基熔化再使用應不超過一次。

2.2.5 干粉培養基或培養基原料變質不應再用;預制培養基儲存過程中發現渾濁、變色、長菌、嚴重脫水等變化不應再用。

2.3 對照培養基

對照培養基應通過嚴格的質量研究和控制,具備性能穩定、質量優異的特點。對照培養基作為一種標準試劑,應具備可靠的來源和質量保障。

2.4 培養基適用性檢查指標及常用方法

2.4.1 檢查指標:促生長能力、指示能力、抑制能力。

2.4.2 常用方法:直接接種法、澆碟法、表面接種法(涂布法)。

2.4.3 液體培養基通常采用直接接種法測定上述3種指標,接種時應注意接種量不得超過培養基體積的10%。固體培養基采用澆碟法和表面接種法測定上述指標。采用澆碟法考察固體培養基時,為了保證取樣的平行性,平行測定兩皿求平均數;采用表面接種法(涂布法)考察固體培養基時,表面接種菌液不多于0.2ml/皿,盡量控制在0.1ml/皿,保證取樣間的平行性,平行測定兩皿觀察結果。

3 計數培養基的適用性檢查

微生物限度檢查中計數用培養基有3種,營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂和酵母浸出粉葡萄糖瓊脂。

3.1 計數培養基適用性檢查試驗用菌株

大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]

白色念珠茵(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]

黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]

菌株的培養及菌液制備同微生物限度檢查方法驗證。

3.2 實驗操作

3.2.1 培養基制備按規定程序新鮮配制營養瓊脂(被檢培養基和對照培養基)、玫瑰紅鈉瓊脂(被檢培養基和對照培養基)以及酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(被檢培養基和對照培養基),滅菌后備用。

3.2.2 營養瓊脂培養基取7個無菌平皿,分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿,每皿接種1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接種菌作為空白對照,傾注對照營養瓊脂培養基,混勻,凝固后于30~35℃倒置培養48h,計數;被檢培養基同法操作。

3.2.3 玫瑰紅鈉瓊脂培養基取5個無菌平皿,分別接種白色念珠菌、黑曲霉菌各2皿;每皿接種1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接種菌作為空白對照,傾注對照玫瑰紅鈉瓊脂培養基,混勻,凝固后于倒置培養72h,計數;被檢培養基同法操作。

3.2.4 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基取3個無菌平皿,分別接種白色念珠菌2皿,每皿接種1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接種菌作為空白對照,傾注對照酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固后倒置培養72h,計數;被檢培養基同法操作。

3.3 結果判斷

若被檢培養基上的菌落平均數不小于對照培養基上的菌落平均數的70%,且菌落形態、大小應與對照培養基上的菌落一致,則判斷該培養基的適用性檢查符合規定。

4 控制菌檢查用培養基適用性檢查

控制菌檢查用成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配置的培養基均應檢查。檢查項目包括培養基的促生長、指示和抑制特性能力。

4.1 計數培養基適用性檢查試驗用菌株

大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]

乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]

菌株的培養及菌液制備同微生物限度檢查方法驗證。

4.2 各種培養基需要測試的能力及判斷指標

液體培養基促生長能力檢查:取不大于100cfu的試驗菌分別接種于被檢培養基和對照培養基中,在相應控制菌檢查規定的培養溫度(30~35℃)及最短培養基時間下培養。增菌培養基多為澄清液體培養基,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁。

固體培養基促生長能力檢查:取試驗菌液0.1ml(含菌數50~100cfu)分別涂布于被檢培養基和對照培養基上,在相應控制菌檢查規定的培養溫度(30~35℃)及最短培養基時間下培養。

與對照培養基比較,被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征應一致。

液體培養基指示能力檢查:取不大于100cfu的試驗菌分別接種于被檢培養基和對照培養基中,在相應控制菌檢查規定的培養溫度(30~35℃)及最短培養基時間下培養。與對照培養基管比較,被檢培養基中試驗菌應生長情況/指示劑反應等應與對照培養基一致。

固體養基指示能力檢查:取試驗菌液0.1ml(含菌不大于100cfu)分別涂布于被檢培養基和對照培養基上,在相應控制菌檢查規定的培養溫度(30~35℃)及培養基時間下培養。被檢培養基上試驗菌的茵落形態特征、菌落顏色及指示劑反應情況應與對照培養基一致。

培養基抑制能力檢查:取不大于100cfu的試驗菌分別接種于液體被檢培養基和對照培養基,取試驗菌0.1ml液(不大于100cfu)分別涂布于固體被檢培養基和對照培養基,在相應控制菌檢查規定的培養溫度(30~35℃)及最長培養基時間下培養,試驗菌應不得生長。

4.3 控制菌檢查用培養基能力測試列表(表7)

控制菌檢查涉及的21種培養基,特點各異。表格中概述培養基檢查的具體項目,具體操作程序在其后說明。

表7 控制菌檢查用培養基適用性檢查項目、菌株及判斷指標

培養基

測試菌株

測試特性

測試指標

膽鹽乳糖培養基

大腸埃希菌

促生長能力

渾濁

銅綠假單胞菌

渾濁

金黃色葡萄球菌

抑制能力

未見渾濁

MUG培養基

大腸埃希菌

促生長能力

渾濁

大腸埃希菌

指示能力

366nm有熒光

曙紅亞甲藍瓊脂

或麥康凱瓊脂

大腸埃希菌

促生長能力

回收率

乙型副傷寒沙門菌

回收率

大腸埃希菌

指示能力

顏色形態同對照

乙型副傷寒沙門菌

顏色形態同對照

乳糖膽鹽發酵管

大腸埃希菌

促生長能力

渾濁產氣

金黃色葡萄球菌

抑制能力

未見渾濁

乳糖發酵培養基

大腸埃希菌

促生長能力

渾濁

大腸埃希菌

指示能力

產氣

營養肉湯

乙型副傷寒沙門菌

促生長能力

渾濁

金黃色葡萄球菌

促生長能力

渾濁

四硫磺酸鈉亮綠培養基

乙型副傷寒沙門菌

促生長能力

上清渾濁

金黃色葡萄球菌

抑制能力

上清未見渾濁

膽鹽硫乳瓊脂

或沙門、志賀屬瓊脂

乙型副傷寒沙門菌

促生長能力

回收率

乙型副傷寒沙門菌

指示能力

顏色形態同對照

溴化十六烷基三甲銨

瓊脂

銅綠假單胞菌

促生長能力

回收率

大腸埃希菌

抑制能力

不得生長

綠膿菌素測定用培養基

銅綠假單胞菌

促生長能力

回收率

銅綠假單胞菌

指示能力

顏色形態同對照

亞碲酸鹽肉湯培養基

金黃色葡萄球菌

促生長能力

渾濁

大腸埃希菌

抑制能力

未見渾濁

卵黃氯化鈉瓊脂或

甘露醇氯化鈉瓊脂

金黃色葡萄球菌

促生長能力

回收率

金黃色葡萄球菌

指示能力

顏色形態同對照

大腸埃希菌

抑制能力

不得生長

培養基

測試菌株

測試特性

測試指標

梭菌增菌培養基

生孢梭菌

促生長能力

渾濁

哥倫比亞瓊脂

生孢梭菌

促生長能力

回收率

沙氏葡萄糖肉湯

白色念珠菌

促生長能力

渾濁

沙氏葡萄糖瓊脂

白色念珠菌

促生長能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

顏色形態同對照

念珠菌顯色培養基

白色念珠菌

促生長能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

顏色形態同對照

白色念珠菌

抑制能力

不得生長

1%聚山梨醋80-玉米

瓊脂培養物

白色念珠菌

促生長能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

顏色形態同對照

4.4 各控制菌檢查用培養基適用性檢查實驗操作

控制菌檢查用培養基數量較多,特點各不相同。為了避免培養基配制過程出現遺漏,此處特別提示以下幾個需要特殊注意到培養基:

不可高壓滅菌只能加熱煮沸滅菌的培養基3種:DHL瓊脂、SS瓊脂和念珠菌顯色培養基;

需要添加試劑的培養基3種:TTB培養基、亞碲酸鹽肉湯和哥倫比亞瓊脂培養基。

以下敘述各培養基適用性檢查的具體操作過程:

4.4.1 膽鹽乳糖培養基 新鮮配制100ml/瓶的對照膽鹽乳糖培養基4瓶,121℃滅菌15min。備用。分別接種大腸埃希菌、銅綠假單胞菌以及金黃色葡萄球菌各1瓶,接種菌液量1ml(不大于100cfu),另一瓶不接種菌作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18小時,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁;培養48小時,空白培養瓶和接種金黃色葡萄球菌的培養瓶應不得渾濁;

4.4.2 MUG培養基新鮮配制5ml/支的對照MUG培養基,121℃滅菌15min,備用。取3支,接種大腸埃希菌2支,接種菌液0.2ml(不大于100cfu),另一支不接種菌作為空白對照,培養5小時。在366nm紫外光燈下觀察結果;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養??瞻着囵B管應不得渾濁,且366nm處觀察無熒光;與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁,366nm處應呈現熒光。若熒光不明顯,則可延長至24h觀察。

4.4.3 曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB) 新鮮配制對照EMB瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取5個無菌EMB瓊脂平板,分別涂布接種大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門菌各2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養18h,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養24h,空白平板應無菌落生長。

4.4.4 麥康凱瓊脂培養基 新鮮配制對照麥康凱瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取5個無菌麥康凱瓊脂平板,分別涂布接種大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門菌各5皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養18小時,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養24小時,空白平板應無菌落生長。

4.4.5 乳糖膽鹽發酵培養基 新鮮配制10m/支的對照膽鹽乳糖培養基,121℃滅菌15min,備用。取5支,分別接種大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌,各2支,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接種菌作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18h,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變色、渾濁,且倒管中應有明顯的產氣現象;培養24h,空白培養管和接種金黃色葡萄球菌的培養管應不得變色、不得渾濁。

4.4.6 乳糖發酵培養基 新鮮配制10ml/支的對照乳糖發酵培養基,121℃滅菌15min,備用。取3支,接種大腸埃希菌2支,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接種菌作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18h,與對照培養基比較.被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變色、渾濁,且有導管中應有明顯的產氣現象;培養24h,空白培養管應不得變色、不得渾濁。

4.4.7 營養肉湯培養基 新鮮配制100ml/瓶的對照營養肉湯培養基3瓶,121℃滅菌15min,備用。分別接種乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌各1瓶,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接種菌株作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18h,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁;培養48h,空白培養瓶應不得渾濁。

4.4.8 四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB) 新鮮配制10ml/支的對照TTB培養基基礎,121℃滅菌15min,備用。臨用前,無菌操作加入0.2ml碘試液和0.lml亮綠試液。取5支,分別接種乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌各2支,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接種菌作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18h,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基上清渾濁;培養24h,空白的培養管和接種金黃色葡萄球菌的培養管應不得渾濁。

由于TTB中的碳酸鈣對渾濁現象觀察有影響,因此若渾濁現象不明顯,則將各培養物接種至膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門、志賀屬瓊脂(SS)平板上劃線觀察TTB培養物生長情況,空白對照和接種金黃色葡萄球菌的培養管劃線后應無菌落生長,對照和被檢TTB培養基劃線接種至瓊脂平板后應有菌落生長,且顏色形態一致。

4.4.9 膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL) 新鮮配制對照DHL瓊脂培養基,加熱充分溶解,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個無菌DHL瓊脂平板,涂布接種乙型副傷寒沙門菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養18h,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養48h,空白平板應無菌落生長。

4.4.10 沙門、志賀屬瓊脂培養基(SS) 新鮮配制對照SS瓊脂培養基,加熱充分溶解,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個無菌SS瓊脂平板,涂布接種乙型副傷寒沙門菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養18h,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養48h,空白平板應無菌落生長。

4.4.11 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基基礎 新鮮配制對照溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取7個無菌瓊脂平板,分別涂布接種銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各3皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養18h,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養24h,空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落生長。

4.4.12 綠膿菌素測定用培養基(PDP) 新鮮配制對照綠膿菌素測定用培養基基礎,每升培養基中加入10ml甘油,121℃滅菌15min,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個無菌綠膿菌素測定用瓊脂平板,涂布接種銅綠假單胞菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養24h;被檢培養基同法操作??瞻灼桨鍛獰o菌落生長,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致。

4.4.13 亞碲酸鹽肉湯培養基 新鮮配制100ml/瓶的對照營養肉湯培養基3瓶,121℃滅菌15min,備用。臨用加入新鮮配制的無菌1%亞碲酸鹽0.2ml。分別接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各1瓶,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接種菌株作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養18h,與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變黑、變渾濁;培養48h,空白培養瓶和接種大腸埃希菌的培養瓶應不得渾濁。

4.4.14 卵黃氯化鈉瓊脂培養基新鮮配制對照卵黃氯化鈉瓊脂培養基基礎,121℃滅菌15min,冷卻至60℃,參照2010版《中國藥典》比例無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液,充分振搖后傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取5個無菌瓊脂平板,分別涂布接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養24h,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養72h,空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落生長。

4.4.15 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基 新鮮配制對照甘露醇氯化鈉瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取5個無菌瓊脂平板,分別涂布接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~1000fu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養24小時,被檢培養基菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養72h,空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落生長。

4.4.16 梭菌增菌培養基 新鮮配制100ml/瓶的對照梭菌增菌培養基2瓶,121℃滅菌15min,備用。接種生孢梭菌1瓶,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接種菌株作為空白對照,置規定溫度的厭氧條件培養48h;被檢培養基同法操作??瞻着囵B瓶應不得渾濁;與對照培養基比較,被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁。

4.4.17 哥倫比亞瓊脂培養基 新鮮配制對照哥倫比亞瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃后傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個哥倫比亞瓊脂平板,涂布接種生孢梭菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后置規定溫度的厭氧條件下倒置培養;被檢培養基同法操作。48小時空白平板應無菌落生長,被檢培養基菌落大小、形態特征應與對照培養基上的菌落一致。

哥倫比亞瓊脂培養基營養豐富,適宜多數需氧菌的生長,為了消除其它雜菌生長對檢查結果的影響,可在每升滅菌后培養基中按無菌操作添加含有相當于20mg慶大霉素的硫酸慶大霉素。添加慶大霉素的哥倫比亞瓊脂可參照上述方法進行培養基適用性考察。

4.4.18 沙氏葡萄糖肉湯培養基 新鮮配制100ml/瓶的對照沙氏葡萄糖肉湯培養基2瓶,121℃滅菌15min,備用。接種白色念珠菌1瓶,接種菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接種菌株作為空白對照;被檢培養基同法操作,置規定溫度培養。培養48h,與對照培養基比較。被檢培養基中試驗菌應生長良好,表現為液體培養基變渾濁;培養72h,空白培養瓶應不得渾濁。

4.4.19 沙氏葡萄糖瓊脂培養基 新鮮配制對照沙氏葡萄糖瓊脂培養基,121℃滅菌15min,冷卻至60℃后,傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個沙氏葡萄糖瓊脂平板,涂布接種白色念珠菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養24h,被檢培養基上的菌落大小、形態特征、顏色及氣味應與對照培養基上的菌落一致;培養72h,空白平板應無菌落生長。

4.4.20 念珠菌顯色培養基 新鮮配制對照念珠菌顯色培養基,加熱充分溶解,冷卻至60℃傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。念珠菌顯色平板使用前避光保存,取5個無菌念珠菌顯色平板,分別涂布接種白色念珠菌和大腸埃希菌各2皿,接種0.1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養24h,被檢培養基上的菌落大小、形態特征及顏色應與對照培養基上的菌落一致;培養72h,空白平板和接種大腸埃希菌的平板應無菌落生長。

4.4.21 1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基 新鮮配制對照1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基基礎,每升培養基中加入10ml聚山梨酯80,121℃滅菌15min,冷卻至60℃后,傾注平皿,35℃培養箱預培8h后備用。取3個1%聚山梨酯80-玉米瓊脂平板,涂布接種白色念珠菌2皿,接種菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接種菌作為空白對照,涂布均勻后于規定溫度倒置培養;被檢培養基同法操作。培養24h,被檢培養基菌落的大小、形態特征及芽管指示能力應于與對照培養基上的菌落一致;培養48h,空白平板應無菌落生長。

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